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黄体生成素释放激素(luteinizinghormone-releasinghormone，LHRH)是下丘脑神经元分泌的由十个氨基酸组成的多肽类激素。在体内，其可以促进黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的生成释放，从而调节机体的生长发育与生殖以及与性激素有关的过程。近年研究表明，LHRH类似肽类化合物可作为拮抗剂直接或间接抑制多种恶性肿瘤的发生发展。 本课题所研究的LHRH的拮抗剂是由军事医学科学院毒物药物研究所研制合成的、具有新结构特点的十肽类先导化合物。初步的药效学研究结果表明，比已上市的药物有明显的技术优势，目前已申请了中国及国外发明专利。 本论文研究的目的是建立体外多种蛋白酶体系和组织匀浆中的代谢评价模型体系，用以快速筛选出具有代谢稳定性的化合物，并阐明LHRH拮抗剂的酶解机制;同时探讨该类先导化合物的代谢途径;利用液相色谱-质谱联用技术建立“Ninone"（同时测定多个分子量不同的药物的代谢行为）的快速体内代谢预测模型;利用Caco-2细胞模型研究其跨膜转运特征，揭示该类化合物的吸收行为。通过以上对LHRH拮抗剂的体内外代谢稳定性和跨膜转运特征的研究，为该类先导化合物的活性筛选、综合代谢性能优化提供可行的研究途径。 一、LHRH拮抗剂在体外多种蛋白酶体系中的代谢稳定性 采用盒式给药(Ninone)的方法研究了LHRH拮抗剂在胰混合酶和胃蛋白酶中的代谢稳定性，建立了用胰混合酶快速评价LHRH拮抗剂体外稳定性的模型。以LHRH拮抗剂Degarelix为阳性对照药，以各个肽的半衰期为考查指标，评价了11种LHRH拮抗剂的体外酶反应的稳定性，从中筛选出5种有较高代谢稳定性的肽类。 11种LHRH拮抗剂与胰混合酶一起温孵时，代谢最慢的是LY616，半衰期是330min，代谢最快的是TRD122，半衰期是44min。相对于在胰混合酶中的代谢，LHRH拮抗剂在胃蛋白酶中的代谢很慢，温孵4h后，原型药物的剩余率在80％以上。说明所合成的肽类在胰混合酶中降解的速度和程度都比在胃蛋白酶中大，提示可以用胰混合酶对该类化合物进行早期代谢稳定性的评价。稳定性结果显示，11种肽中有8种肽在胰混合酶中的稳定性优于阳性对照药Degarelix，结合该类化合物的药效实验，用该模型筛选出稳定性较好的5个肽是LY616、LY617、LY618、LY608和LY609。 二、LHRH拮抗剂在大鼠组织匀浆中的代谢稳定性 采用液相色谱-多级质谱联用(LC-MS/MS)技术，分别在大鼠肝、肾和肺组织匀浆中的代谢稳定性模型体系上，建立了用盒式给药检测的方法对5种LHRH拮抗剂进行了快速评价。 LHRH拮抗剂在大鼠的组织匀浆中温孵1小时后，5种肽在肝匀浆中的原型药物残留量均小于30％;在肾和肺匀浆中，除LY618外，其他四种肽的残留量均大于60％，而未加匀浆的对照组在4h的温孵时间内没有明显的降解。5种肽在三种匀浆中的降解速率大小分别是肝＞肾＞肺，半衰期范围是7.5至462min。其中LY618在肝匀浆中的半衰期最短，为7.5min，而LY616和LY608在肝匀浆中的半衰期为36min，是5种肽中代谢最慢的。5种肽在肾和肺匀浆中的半衰期均比在肝匀浆中的半衰期长，提示这类肽在肾和肺匀浆中比在肝匀浆中要稳定。 三、LHRH拮抗剂的酶解机制 为了探讨LHRH拮抗剂的酶解机制，以便为该类化合物的结构优化提供实验依据，本文以四种酶抑制剂，即氨肽酶抑制剂Amastatin和Bestatin、金属酶抑制剂EDTA四钠盐、丝氨酸蛋白酶抑制剂Phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)、胰蛋白酶抑制剂Soybean与LY618和大鼠肝匀浆一起温孵，通过考查各抑制剂对LHRH类似肽的代谢影响，寻找可能参与LHRH拮抗剂代谢的蛋白酶。 LHRH拮抗剂LY618在与大鼠肝匀浆和各种酶抑制剂共同温孵1h后，加入抑制剂Amastatin、Bestatin和PMSF的实验组，原型药物的剩余量明显高于对照组，有显著性差异(p＜0.01);加入胰蛋白酶抑制剂Soybean的实验组，原型药物的剩余量也高于对照组(p＜0.05)。四种蛋白酶抑制剂对LY618在肝匀浆中代谢抑制作用的大小依次是:Amastatin＞PMSF＞Bestatin＞Soybean,而金属蛋白酶对此没有明显的抑制作用。说明LHRH拮抗剂在肝匀浆中的代谢可能主要受氨肽酶、丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的作用。提示在该类化合物的结构优化中，应注意修饰这几种蛋白酶所作用的氨基酸结合位点。 四、LHRH拮抗剂LY618在大鼠肝匀浆中的代谢产物分析 为了进一步明确这类肽的代谢产物与代谢途径机制，本文采用LC-MSn方法，通过综合分析药物原型代谢产物的准分子离子、多级碎片离子和色谱保留时间，并与原型药物比对，以LY618为代表研究了LHRH十肽在肝匀浆中的主要代谢产物。结果显示，LHRH拮抗剂在大鼠肝匀浆中代谢时，首先被内肽酶水解，酶解位置在3位Pal3和4位Ser4、4位Set4和5位Aph(Hor)5之间，以及7位Leu7和8位Ilys8之间。即含有Pal、Ser、Leu和Ilys的酰胺键中容易发生水解。水解产物进一步代谢，可以发生羟化反应（如仲胺形成羟胺、去甲基加两个羟基化）、氧化脱氯、氨基酸侧链的羟基脱水、脱烷基（如脱去异丙基赖氨酸侧链中的异丙基）。阐明这些断裂位点为优化该类化合物结构、提高其代谢稳定性提供了研究思路。 五、LHRH拮抗剂在大鼠体内的代谢稳定性 采用盒式给药方法，建立了用LC-MS/MS方法快速评价5种LHRH拮抗剂在大鼠体内的代谢稳定性的模型。按照0.4mg/kg的量，同时给大鼠单剂量静脉注射5个肽的混合物后，在不同时间内测定5种LHRH拮抗肽的血药浓度。结果显示，5种LHRH拮抗肽的血浆药物浓度-时间曲线符合二室模型，五个肽的消除半衰期在0.77至2.39h之间，清除率在0.02至0.16L之间，表观分布容积在0.011至0.15L/kg之间，药时曲线下面积在2.59至20.11μgh/ml之间。5个化合物的主要药动学参数存在明显差异。但总体情况是，5个肽在大鼠体内的代谢均较快，其消除半衰期长短依次是LY616＞LY608＞LY617＞LY609＞LY618。结果说明，5个十肽化合物中，LY616在体内代谢最慢，半衰期为2.39h;而代谢最快的是LY618，半衰期仅为0.77h。这一结果与体外稳定性研究结果一致（见第一章和第二章），这也说明所建立的模型适合快速评价LHRH类似肽的体内代谢稳定性。 六、LHRH拮抗剂的在Caco-2细胞中的转运 采用Caco-2细胞模型研究了LHRH拮抗剂LY616的转运机制。以Millicell插入式细胞培养皿培养Caco-2细胞，双向转运实验在0.6mg/ml、0.3mg/ml和0.15mg/ml三个浓度下进行。结果显示，不同浓度下的LY616在Caco-2细胞中的表观渗透系数无显著性差异，说明其转运机制可能是被动转运;将同一浓度下其A侧到B侧的表观渗透系数与B侧到A侧的表观渗透系数相比，除高浓度外，其他组无显著性差异，即Papp(B-A)/Papp(A-B)接近于1，也证明了其转运以被动转运为主。实验中曾以P-糖蛋白抑制剂维拉帕米和LY616共同转运，结果证实，与不加维拉帕米的对照组相比，没有显著性差异，说明LY616不是外排蛋白P-糖蛋白的底物。实验测得LHRH拮抗剂的Papp,在3×10-7cm/s左右，表示其在体内吸收不完全。这些结果可为研究该类药物的体内吸收提供参考。 综上所述，所建立的混合酶模型、组织匀浆模型和“Ninone"的快速体内代谢预测模型适合于LHRH拮抗剂的体内外代谢稳定性的早期快速评价，利用这些模型评价了11种LHRH拮抗剂的类似肽。对该类先导化合物的体内外代谢稳定性、酶解位点、代谢途径和跨膜转运特征综合研究结果显示:11种LHRH拮抗剂的体内外代谢较快，但有8种LHRH拮抗剂的稳定性优于已上市的阳性对照药Degarelix，其中体内外代谢稳定性均较好的是LY616。这类肽的代谢主要是受氨肽酶、丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的酶解作用。代谢时首先被内肽酶水解，酶解在含有Pal、Ser、Leu和Ilys的肽键容易发生，水解产物可进一步被代谢，可以发生羟化、氧化脱氯、氨基酸侧链的羟基脱水、脱烷基等反应。LHRH拮抗剂的跨膜转运为被动转运，优于已上市的同类药物布舍瑞林和海沙瑞林。