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本实验收集了河南、浙江、陕西等主产地山茱萸各品种的叶片标本60份,进行RAPD,建立山茱萸的DNA遗传图谱,分析各品种之间的亲缘关系,确定山茱萸优良品种的DNA指纹图谱,并用其筛选山茱萸优良品种。主要结果如下:
1.在经典的CTAB法的基础上,对提取条件进行了改进,确定了提取总DNA的方法,该法从山茱萸叶片中提取的总DNA收率为1376μg/g~8256μg/g,经过琼脂糖电泳检测,紫外吸收检测表明,提取的总DNA杂质少、质量好,RAPD扩增效果良好。
2.对RAPD扩增反应体系和温度循环参数进行了优化:(1)反应体系:25μl反应体系,其中10×buffer2.5μl,dNTP(2.5mmol/L)3.0μl,Mg2+(25mmol/L)3.0μl,引物(2μmol/L)2.5μl,模板DNA(137.6μg/g~825.6μg/g)2.5μl,Taq酶(5U/μl)1μl,去离子水10.5μl。扩增产物在1×TAE电泳缓冲液中用1.2%琼脂糖凝胶电泳,电压为每厘米3-4伏,电泳完毕用0.5μg/ml的EB染色,拍照。(2)扩增程序:94℃预变性8min,94℃变性,1min,38℃退火,1min,72℃延伸,1.5min,共35个循环。72℃10min补齐。其中变性94℃到退火38℃的降温时间延长1min,退火38℃到延伸72℃的升温时间延长1min。
3.从100条上海生工S系列10bp的随机引物中筛选出7条扩增好、多态性稳定的引物。将这些引物用于60份材料的扩增,扩增片段大小为200bp~2000bp。从7个引物产生的谱带中共获得53个位点,其中44个位点具有多态性,多态率达到83%,说明样品具有很好的遗传多样性。
本试验以各样本之间的遗传距离为聚类统计变量,采用SPSS11.0软件计算DICE遗传相似性系数,Between-groupsLinkage方法聚类,构建亲缘关系树系图。由聚类图可以看到,河南产短圆柱形果型自成一类,和另外几种果型的亲缘关系较远。不同产地的椭圆形果型,长圆柱形果型和短梨形果型分别聚在了一起,表明这三种果型保持了较好的遗传独立性。圆柱形果型和长梨形果型亲缘关系较近,并且对于同一果型来说,产地的差异大于个体的差异。浙江产的短圆柱形果型4份样品聚为一类,保持着较好的遗传稳定性。从树状图也可以看出各栽培品种之间的遗传关系,遗传位点比较丰富的品种长圆柱形果型和短梨形果型首先聚在一起,然后是圆柱形果型、椭圆形果型、长梨形果型聚为一大类。实验结果支持了种内变异类型按照不同果型分类的方法,为山茱萸按照不同果型的分类提供了分子水平的依据。