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同源四倍体水稻是二倍体水稻经染色体加倍而成的水稻种质，该种质具有粒重加大和营养品质提高等优点，特别是利用籼型和粳型同源四倍体水稻杂交，其F1具有明显的生物学优势，有增产的潜力。但同源四倍体水稻育性普遍偏低，难以直接应用，因此，开展同源四倍体水稻低育性的细胞和分子遗传机理研究具有重要意义。同源四倍体水稻低育性的细胞学机理已有许多报道，但对于分子遗传机理的研究却不多见，特别是非编码RNAs表观遗传学方面的研究鲜有报道。为此，本文利用低育性的同源四倍体水稻，以其二倍体原种为对照，一是通过整体曙红B染色透明激光扫描共聚焦显微镜术（WE-CLSM）等技术对所用材料花粉和胚囊发育过程以及细胞遗传学进行系统研究；二是通过高通量测序技术对全基因组序列变异、重要时期基因表达谱和甲基化特征进行研究；三是重点对其花粉和胚囊发育过程miRNAs和长链非编码RNAs （lncRNAs）变化进行深入研究。最后进行综合分析，以阐明同源四倍体水稻低育性的细胞和分子遗传机理。主要研究结果如下：
（1）同源四倍体水稻花粉和胚囊发育过程的细胞学观察
细胞学研究结果表明，同源四倍体水稻（02428-4x）花粉和胚囊发育过程与二倍体原种（02428-2x）一致，可以明确进行分期，但前者发育过程存在多种异常现象。其中花粉发育过程存在花粉母细胞退化、多核仁、异常四分体、异常单核和二胞花粉等异常现象，导致花粉育性显著降低，其育性仅为43.3%；胚囊发育过程出现功能大孢子退化、异常单核胚囊、胚囊早期退化、极核异常和双胚囊等异常现象，导致胚囊育性为 55.48％。同源四倍体水稻花粉母细胞减数分裂过程出现多价体、中期染色体拖曳、后期和末期落后染色体、二分体不同步分裂和纺锤体异常等异常现象，终变期染色体构型为Ⅰ（1.03±1.59）+Ⅱ（11.18±5.76）+Ⅲ（0.81±1.14）+Ⅳ（4.83±2.45）+Ⅴ （0.19±0.49）+Ⅵ（0.36±0.90）。此外，02428-4x的花药也发现多种异常现象，如药室退化、绒毡层提前降解、绒毡层细胞发育大小不均等。02428-4x结实率仅为15.65%，其中花粉和胚囊部分败育可能是导致结实率偏低的两个重要原因。
（2）同源四倍体水稻全基因组基因变异分析
重测序结果分析表明，与02428-2x相比，02428-4x存在34416个SNPs和6993个 InDels 的 DNA 多态位点，涉及 2320 个基因的错义突变，其中纯合的变异仅有 4个 基 因 ， 包 括 LOC_Os01g37780 、 LOC_Os09g37270 、 LOC_Os11g27670 和LOC_Os11g35756；大效应变异共涉及 412 个基因，其中纯合的有 4 个，包括LOC_Os03g06260、LOC_Os05g10440、LOC_Os08g24060和LOC_Os11g36880。02428-4x中还发现2777个SVs变异，涉及841个基因，它们被富集到DNA整合、DNA复制、染色质组装或拆分、染色质结合和染色质等途径。另外，02428-4x的84个区域存在CNVs。
（3）同源四倍体水稻花粉母细胞减数分裂期的基因表达谱及甲基化分析
转录组分析发现02428-4x的减数分裂期分别有313个和352个基因特异表达上调和下调，其中下调基因富集在转录因子活性的途径。DNA 甲基化测序分析发现，与二倍体水稻比较，02428-4x 在全基因组甲基化水平上发生了巨大变化。02428-4x 中12457 个区域出现超甲基化水平，47408 个区域表现低甲基化水平。另外，涉及转座子基因的7749个区域也发生低甲基化表达。综合分析还发现，162个差异表达的基因与02428-4x花粉母细胞减数分裂过程相关，其中13个为序列变异基因、149个存在DNA 甲基化差异；42 个基因同时发生序列变异和甲基化差异；4 个基因同时发生三种变异。其中208个基因，包括LOC_Os03g58600（MEL1）、LOC_Os03g44760（OsAM1）、LOC_Os08g03682（CYP703A3）和 LOC_Os10g35180（OsABCG26）等花粉发育重要基因的变异或表达异常可能影响同源四倍体水稻花粉的发育，导致育性降低。
（4）同源四倍体水稻花粉和胚囊发育过程的小分子RNAs分析
小分子RNAs测序分析表明，在02428-4x和02428-2x共发现748个miRNAs，其中 43 和 49 个 miRNAs 分别在 02428-4x 的花粉发育和胚囊发育中特异表达。与02428-2x相比，321个miRNAs在02428-4x的花粉发育过程中差异表达；368个在胚囊发育过程中差异表达。花粉发育富集miRNAs预测到207个靶基因，与在花发育和转录因子活性相关；胚囊发育富集miRNAs预测到106个靶基因，与在细胞分化、细胞死亡和信号转导相关。进一步分析发现与减数分裂相关差异表达的4个miRNAs，包括 osa-miR159a.1 和 osa-MIR159a-p5 与花粉母细胞减数分裂相关 ；osa-miR1436_L+3_1ss5CT 和 osa-miR167h-3p 与胚囊母细胞减数分裂相关。此外， 21nt-phasiRNAs和24nt-phasiRNAs的触发子miR2118和miR2275家族，在同源四倍体水稻花粉发育过程中表现富集；花粉相关的24nt-phasiRNAs在02428-4x花粉发育过程中呈现下调表达，其差异表达模式与其触发子osa-miR2275d时空表达模式相符，表明24nt-phasiRNAs和osa-miR2275d在同源四倍体水稻花粉发育中起重要作用。本研究还在同源四倍体水稻中发现大量差异表达的24nt TEs-siRNAs，其表达模式在花粉和胚囊发育中呈现反向规律性，在四倍体胚囊发育过程中上调表达，而在花粉发育中下调表达，由此可能造成转座子调控失衡从而导致同源四倍体水稻基因组不稳定性和败育。
（5）同源四倍体水稻花粉和胚囊发育过程长链非编码RNAs分析
长链非编码RNAs测序分析表明，与二倍体原种（台中65-2x）比较，同源四倍体水稻（台中65-4x）分别有431和32个lncRNAs在花药和子房中差异表达。与小分子RNAs群体的关联分析发现，59个差异表达lncRNAs可作为前体产生差异小分子RNAs，其中的55个在台中65-4x中显著下调。同时还发现328个差异lncRNAs含有转座子，在台中 65-4x 花药中具有比台中 65-2x 更低的相对表达水平。对差异表达lncRNAs 的靶基因进行富集分析发现，花发育、DNA 结合和核途径与同源四倍体水稻花药发育相关，而非生物刺激的反应则与子房发育相关。进一步分析发现，其中237个和20个差异lncRNAs分别与花粉和胚囊母细胞减数分裂基因相关，大部分呈下调表达，如TCONS_00068868（调控MEL1）和TCONS_00057811（调控meiotic asynaptic mutant 1）等。这些与小分子RNAs群体、转座子和减数分裂相关lncRNAs的差异表达可能造成同源四倍体水稻的花粉和胚囊败育。
综上认为，引起同源四倍体水稻低育性的原因有多方面，在细胞遗传学层面，主要是染色体行为以及绒毡层发育存在的异常；在分子遗传层面，减数分裂相关基因序列变异、甲基化和差异表达，以及花粉和胚囊发育过程非编码RNAs异常表达等均可能导致其育性偏低，显示其原因的复杂性。
（1）同源四倍体水稻花粉和胚囊发育过程的细胞学观察
细胞学研究结果表明，同源四倍体水稻（02428-4x）花粉和胚囊发育过程与二倍体原种（02428-2x）一致，可以明确进行分期，但前者发育过程存在多种异常现象。其中花粉发育过程存在花粉母细胞退化、多核仁、异常四分体、异常单核和二胞花粉等异常现象，导致花粉育性显著降低，其育性仅为43.3%；胚囊发育过程出现功能大孢子退化、异常单核胚囊、胚囊早期退化、极核异常和双胚囊等异常现象，导致胚囊育性为 55.48％。同源四倍体水稻花粉母细胞减数分裂过程出现多价体、中期染色体拖曳、后期和末期落后染色体、二分体不同步分裂和纺锤体异常等异常现象，终变期染色体构型为Ⅰ（1.03±1.59）+Ⅱ（11.18±5.76）+Ⅲ（0.81±1.14）+Ⅳ（4.83±2.45）+Ⅴ （0.19±0.49）+Ⅵ（0.36±0.90）。此外，02428-4x的花药也发现多种异常现象，如药室退化、绒毡层提前降解、绒毡层细胞发育大小不均等。02428-4x结实率仅为15.65%，其中花粉和胚囊部分败育可能是导致结实率偏低的两个重要原因。
（2）同源四倍体水稻全基因组基因变异分析
重测序结果分析表明，与02428-2x相比，02428-4x存在34416个SNPs和6993个 InDels 的 DNA 多态位点，涉及 2320 个基因的错义突变，其中纯合的变异仅有 4个 基 因 ， 包 括 LOC_Os01g37780 、 LOC_Os09g37270 、 LOC_Os11g27670 和LOC_Os11g35756；大效应变异共涉及 412 个基因，其中纯合的有 4 个，包括LOC_Os03g06260、LOC_Os05g10440、LOC_Os08g24060和LOC_Os11g36880。02428-4x中还发现2777个SVs变异，涉及841个基因，它们被富集到DNA整合、DNA复制、染色质组装或拆分、染色质结合和染色质等途径。另外，02428-4x的84个区域存在CNVs。
（3）同源四倍体水稻花粉母细胞减数分裂期的基因表达谱及甲基化分析
转录组分析发现02428-4x的减数分裂期分别有313个和352个基因特异表达上调和下调，其中下调基因富集在转录因子活性的途径。DNA 甲基化测序分析发现，与二倍体水稻比较，02428-4x 在全基因组甲基化水平上发生了巨大变化。02428-4x 中12457 个区域出现超甲基化水平，47408 个区域表现低甲基化水平。另外，涉及转座子基因的7749个区域也发生低甲基化表达。综合分析还发现，162个差异表达的基因与02428-4x花粉母细胞减数分裂过程相关，其中13个为序列变异基因、149个存在DNA 甲基化差异；42 个基因同时发生序列变异和甲基化差异；4 个基因同时发生三种变异。其中208个基因，包括LOC_Os03g58600（MEL1）、LOC_Os03g44760（OsAM1）、LOC_Os08g03682（CYP703A3）和 LOC_Os10g35180（OsABCG26）等花粉发育重要基因的变异或表达异常可能影响同源四倍体水稻花粉的发育，导致育性降低。
（4）同源四倍体水稻花粉和胚囊发育过程的小分子RNAs分析
小分子RNAs测序分析表明，在02428-4x和02428-2x共发现748个miRNAs，其中 43 和 49 个 miRNAs 分别在 02428-4x 的花粉发育和胚囊发育中特异表达。与02428-2x相比，321个miRNAs在02428-4x的花粉发育过程中差异表达；368个在胚囊发育过程中差异表达。花粉发育富集miRNAs预测到207个靶基因，与在花发育和转录因子活性相关；胚囊发育富集miRNAs预测到106个靶基因，与在细胞分化、细胞死亡和信号转导相关。进一步分析发现与减数分裂相关差异表达的4个miRNAs，包括 osa-miR159a.1 和 osa-MIR159a-p5 与花粉母细胞减数分裂相关 ；osa-miR1436_L+3_1ss5CT 和 osa-miR167h-3p 与胚囊母细胞减数分裂相关。此外， 21nt-phasiRNAs和24nt-phasiRNAs的触发子miR2118和miR2275家族，在同源四倍体水稻花粉发育过程中表现富集；花粉相关的24nt-phasiRNAs在02428-4x花粉发育过程中呈现下调表达，其差异表达模式与其触发子osa-miR2275d时空表达模式相符，表明24nt-phasiRNAs和osa-miR2275d在同源四倍体水稻花粉发育中起重要作用。本研究还在同源四倍体水稻中发现大量差异表达的24nt TEs-siRNAs，其表达模式在花粉和胚囊发育中呈现反向规律性，在四倍体胚囊发育过程中上调表达，而在花粉发育中下调表达，由此可能造成转座子调控失衡从而导致同源四倍体水稻基因组不稳定性和败育。
（5）同源四倍体水稻花粉和胚囊发育过程长链非编码RNAs分析
长链非编码RNAs测序分析表明，与二倍体原种（台中65-2x）比较，同源四倍体水稻（台中65-4x）分别有431和32个lncRNAs在花药和子房中差异表达。与小分子RNAs群体的关联分析发现，59个差异表达lncRNAs可作为前体产生差异小分子RNAs，其中的55个在台中65-4x中显著下调。同时还发现328个差异lncRNAs含有转座子，在台中 65-4x 花药中具有比台中 65-2x 更低的相对表达水平。对差异表达lncRNAs 的靶基因进行富集分析发现，花发育、DNA 结合和核途径与同源四倍体水稻花药发育相关，而非生物刺激的反应则与子房发育相关。进一步分析发现，其中237个和20个差异lncRNAs分别与花粉和胚囊母细胞减数分裂基因相关，大部分呈下调表达，如TCONS_00068868（调控MEL1）和TCONS_00057811（调控meiotic asynaptic mutant 1）等。这些与小分子RNAs群体、转座子和减数分裂相关lncRNAs的差异表达可能造成同源四倍体水稻的花粉和胚囊败育。
综上认为，引起同源四倍体水稻低育性的原因有多方面，在细胞遗传学层面，主要是染色体行为以及绒毡层发育存在的异常；在分子遗传层面，减数分裂相关基因序列变异、甲基化和差异表达，以及花粉和胚囊发育过程非编码RNAs异常表达等均可能导致其育性偏低，显示其原因的复杂性。