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棉花作为一种重要的经济作物，被视为很多发展中国家经济的支柱。它不仅为世界经济提供优质纤维，而且还提供棉籽油。然而，在棉花的生长发育时期，经常会遭受各种生物和非生物胁迫，每年因这些胁迫造成的产量损失十分巨大。因此，迫切需要制定针对这些胁迫的广谱抗性策略。传统的育种方法耗时并且仅提供有限的解决方案，长期生产实践和深入研究表明，通过基因工程对抗性基因的挖掘和应用是实现广谱抗性最有效的方法。在植物应对生物和非生物胁迫反应时，氧脂及其衍生物，如茉莉酸，二乙基醚，挥发类醛等发挥着重要作用。这些氧脂类化合物的合成由LOXs催化，LOX是非血红素，含铁的双加氧酶，直接或间接地参与到植物的防御反应。因此，本研究旨在全面而系统的研究棉花中的LOX基因家族，并从中筛选出响应生物和非生物胁迫的候选LOXs基因并进行功能验证。本研究的主要结果如下:
1、在全基因组范围内鉴定棉花中的LOX基因
本研究从陆地棉（G.hirsutum），海岛棉（G.barbadense），亚洲棉(G.arboreum)，雷蒙德氏棉(G.raimondii)中共鉴定到64个可能的LOX基因。进化树分析发现，这些LOX基因可以分为3类（9-LOX，Ⅰ型13-LOX，Ⅱ型13-LOX）。研究发现从A2到At亚组，D5到Dt亚组存在LOX基因的部分复制暗示着在四倍体棉种(陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G.barbadense)）训化过程中存在异源多倍化过程。基因结构和功能域分析发现，不同亚家族的GhLOX基因相对保守。此外，在GhLOX基因的启动子区域中发现许多与生长，应激和植物激素信号转导相关的顺式作用元件。基因表达分析显示，所有GhLOX基因至少在两个组织中都有表达，而且绝大多数的GhLOX基因受到高温和盐胁迫诱导上调表达。另外，一些基因特异受到外源激素处理诱导表达说明这些GhLOX基因可能在调控植物生长和逆境反应中起着重要作用。本研究利用全基因组手段为揭示LOX基因在棉花生长发育和逆境胁迫响应中的生物学作用提供了基础。
2、候选LOX基因在盐胁迫中的功能鉴定
本研究通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法对两个候选的LOX基因(GhLOX12,GhL OX13)进行了功能验证，结果表明，沉默候选LOX基因后增加了棉花对盐胁迫的敏感性。与对照相比，靶基因沉默的植株中叶绿素的含量显著降低，过氧化氢(H2O2)，丙二醛(MDA)，脯氨酸含量显著升高，但是超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低，暗示着沉默LOX基因后，植株清除活性氧的能力显著降低。
3、GbLOX5在棉花响应黄萎病菌(V.dahliae)中的功能研究
分离并克隆了表达序列标签(EST＃S42334867)的全长序列，该基因与先前报道的GhSSN干涉植株RNA-seq中差异表达的LOX5基因同源。GbLOX5的诱导表达模式分析表明，GbLOX5在所有检测的组织中都有表达，包括根，茎干，叶片，花瓣，花药以及胚珠，尤其在花瓣中优势表达。同时该基因也受到接种黄萎病菌以及茉莉酸处理显著诱导表达，暗示着其可能通过调控激素信号路径参与棉花防御系统。
为了研究GbLOX5在棉花抗黄萎病菌中的功能，构建了超表达(35S∷GbLOX5)和RNA干扰(35S∷RNAi GbLOX5)两个载体，并转化到棉花中。GbLOX5-超表达转基因株系表现出更感黄萎病菌，而GbLOX5-RNAi转基因株系增强了棉花对黄萎病菌的抗性。此外，与野生型和对照组相比，在MeJA的处理下，JA合成和信号相关基因的表达在超表达植株中显著降低，而在干涉株系中显著激活，该结果表明，GbLOX5可能是JA信号路径的负调控因子。而且，在黄萎病菌处理条件下，JA合成和信号相关基因的表达在超表达植株中显著降低，而在干涉株系中显著激活，该结果表明，GbLOX5-RNAi株系增强棉花对黄萎病菌的抗性可能是由于JA合成和信号路径激活所致。同样地，还发现与野生型相比，木质素合成相关基因的表达以及木质素含量在GbLOX5-RNAi株系中显著增加，而在GbLOX5-超表达转基因株系中显著降低。这些结果表明GbLOX5-RNAi株系中激活的JA合成和信号路径可能促进了木质素的合成，从而增强了棉花对黄萎病菌的抗性。或者，GbLOX5-超表达株系中抑制了JA合成和信号路径，导致木质素含量的降低，最终削弱了棉花对黄萎病菌的抗性。
1、在全基因组范围内鉴定棉花中的LOX基因
本研究从陆地棉（G.hirsutum），海岛棉（G.barbadense），亚洲棉(G.arboreum)，雷蒙德氏棉(G.raimondii)中共鉴定到64个可能的LOX基因。进化树分析发现，这些LOX基因可以分为3类（9-LOX，Ⅰ型13-LOX，Ⅱ型13-LOX）。研究发现从A2到At亚组，D5到Dt亚组存在LOX基因的部分复制暗示着在四倍体棉种(陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G.barbadense)）训化过程中存在异源多倍化过程。基因结构和功能域分析发现，不同亚家族的GhLOX基因相对保守。此外，在GhLOX基因的启动子区域中发现许多与生长，应激和植物激素信号转导相关的顺式作用元件。基因表达分析显示，所有GhLOX基因至少在两个组织中都有表达，而且绝大多数的GhLOX基因受到高温和盐胁迫诱导上调表达。另外，一些基因特异受到外源激素处理诱导表达说明这些GhLOX基因可能在调控植物生长和逆境反应中起着重要作用。本研究利用全基因组手段为揭示LOX基因在棉花生长发育和逆境胁迫响应中的生物学作用提供了基础。
2、候选LOX基因在盐胁迫中的功能鉴定
本研究通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法对两个候选的LOX基因(GhLOX12,GhL OX13)进行了功能验证，结果表明，沉默候选LOX基因后增加了棉花对盐胁迫的敏感性。与对照相比，靶基因沉默的植株中叶绿素的含量显著降低，过氧化氢(H2O2)，丙二醛(MDA)，脯氨酸含量显著升高，但是超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低，暗示着沉默LOX基因后，植株清除活性氧的能力显著降低。
3、GbLOX5在棉花响应黄萎病菌(V.dahliae)中的功能研究
分离并克隆了表达序列标签(EST＃S42334867)的全长序列，该基因与先前报道的GhSSN干涉植株RNA-seq中差异表达的LOX5基因同源。GbLOX5的诱导表达模式分析表明，GbLOX5在所有检测的组织中都有表达，包括根，茎干，叶片，花瓣，花药以及胚珠，尤其在花瓣中优势表达。同时该基因也受到接种黄萎病菌以及茉莉酸处理显著诱导表达，暗示着其可能通过调控激素信号路径参与棉花防御系统。
为了研究GbLOX5在棉花抗黄萎病菌中的功能，构建了超表达(35S∷GbLOX5)和RNA干扰(35S∷RNAi GbLOX5)两个载体，并转化到棉花中。GbLOX5-超表达转基因株系表现出更感黄萎病菌，而GbLOX5-RNAi转基因株系增强了棉花对黄萎病菌的抗性。此外，与野生型和对照组相比，在MeJA的处理下，JA合成和信号相关基因的表达在超表达植株中显著降低，而在干涉株系中显著激活，该结果表明，GbLOX5可能是JA信号路径的负调控因子。而且，在黄萎病菌处理条件下，JA合成和信号相关基因的表达在超表达植株中显著降低，而在干涉株系中显著激活，该结果表明，GbLOX5-RNAi株系增强棉花对黄萎病菌的抗性可能是由于JA合成和信号路径激活所致。同样地，还发现与野生型相比，木质素合成相关基因的表达以及木质素含量在GbLOX5-RNAi株系中显著增加，而在GbLOX5-超表达转基因株系中显著降低。这些结果表明GbLOX5-RNAi株系中激活的JA合成和信号路径可能促进了木质素的合成，从而增强了棉花对黄萎病菌的抗性。或者，GbLOX5-超表达株系中抑制了JA合成和信号路径，导致木质素含量的降低，最终削弱了棉花对黄萎病菌的抗性。