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主要研究内容包括:第一章:人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外分离、培养及扩增; 1研究目的; 建立hMSCs体外分离、培养及扩增的有效体系,证实无造血细胞系污染、高增殖潜能hMSCs的存在. 2研究方法:Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离、含10﹪FBS的DMEM-LG培养体系贴壁培养、胰酶消化传代扩增,通过形态学、成纤维母细胞集落形成能力(CFU-F)及表型特征对成人骨髓来源的hMSCs进行鉴定;细胞周期分析和成瘤性实验分别反映hMSCs的体外增殖潜能和体内多向分化性.4结论:4.1成功地进行了成人骨髓来源的hMSCs的分离、培养及扩增.4.2形态学、CFU-F集落培养、表型及细胞周期分析表明,所分离、培养及扩增的细胞群中确实存在具有多潜能成体干细胞特性的无造血细胞系污染的hMSCs.4.3成人骨髓来源的hMSCs具有强大的体外扩增潜能,且其体内多向分化性与局部微环境和细胞供源的成熟程度有关,成人骨髓来源的hMSCs可能更适合用于器官或组织特异性病变的临床治疗.第二章:体外诱导hMSCs向造血细胞分化;1研究目的:探索体外定向诱导hMSCs为造血细胞的有效方法,为hMSCs来源的造血干/祖细胞的临床应用以及研究造血细胞分化调控机制奠定基础.2研究方法:选用孕12.5-14.5天(12.5-14.5dpc)的昆明孕鼠,分别制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)及胚胎成纤维细胞饲养层(FD),将hMSCs接种在含FLSC-CM、FD和IL-6及SCF组合的6孔培养板中,培养7-14天后,通过形态学、FACS、粒-单/巨噬系集落形成细胞培养(CFU-GM)以及直接免疫荧光染色检测方法对分化细胞进行鉴定. 4结论:4.1 FLSC-CM可诱导hMSCs分化为具有造血干/祖细胞特性的CD34+CD45+前体细胞,FD作用甚微,而IL-6及SCF并非hMSCs分化为造血细胞所必需的.4.2成人骨髓来源的hMSCs有望成为研究造血分化调控机制很好的细胞模型. 第三章:体外扩增的hMSCs体内造血分化潜能和造血重建; 1研究目的:在体研究hMSCs的造血分化潜能和造血重建能力.2研究方法:建立以hMSCs为供体细胞,化疗(CTX)或全身照射(Co<60>γ射线,TBI)预处理的NOD/SCID小鼠为受体的异种移植模型,分别于hMSCs移植后第4、6、8周,通过生存率、血象、骨髓象、病理组织学、脾指数(SI)等分析受鼠整体造血功能恢复状况;其次,采用造血祖细胞集落体外培养、FACS、免疫细胞和组织化学、直接免疫荧光及PCR的方法对供体细胞源性造血植入和造血重建进行检测,同时比较不同的预处理对hMSCs在造血组织植入水平的影响. 4结论:4.1 hMSCs能在NOD/SCID小鼠造血组织中植入并分化为表型为人CD34+CD45+造血干/祖细胞,后者能重建亚致死剂量射线照射小鼠的造血功能.4.2 hMSCs可以在受体的骨髓、外周血及脾组织植入,但供体源性的造血主要发生在髓外(脾),提示脾脏具有利于hMSCs向造血分化的适宜微环境.4.3 hMSCs-NOD/SCID小鼠异种移植模型为研究hMSCs体内造血分化和造血重建的提供了很好的动物模型.4.4亚致死剂量射线照射可明显腾空骨髓"龛位"以利于供体细胞的"归巢"和植入.