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在人类与病毒长期对抗的过程中,病毒如何入侵机体和机体免疫系统如何应对外来病原,是病毒学家和免疫学家普遍关心的问题。无论是病毒入侵还是免疫应答,病毒和免疫细胞的表面蛋白与其相应受体/配体的相互作用是非常重要的。X射线晶体学的发展帮助我们从原子水平去了解这些相互作用是如何行使生物学功能的。本论文主要集中研究HIV病毒的T细胞免疫和流感病毒表面HA配体的受体结合特性,为HIV病毒和流感病毒的预防和治疗提供必要的理论基础。
HIV病毒的Nef蛋白上有一些重要的免疫优势表位,可以引起良好的T细胞免疫应答,从而控制HW病毒在体内的复制。本论文集中研究两个相互重叠的nef138-10和nef138-8表位及其突变表位的构象比较,通过分析不同的突变表位在MHC凹槽里所递呈的构象,我们总结出2F,2F5C,5C,6L这些突变肽应用的不同的策略去影响TCR的识别,从而实现HIV病毒的免疫逃逸。此外,neff38-10和neff38-8的不同特征性表现,直接影响到其特异性的TCR库的丰度。“特征性”的neff38-10所激发的TCR库比较多样化,容易在不同个体内出现个体特异性的私有TCRs:而“平直”的nef138-8所激发的TCR库比较单一,容易在不同个体内出现共享的公共TCRs。
在长期研究HIV病毒的T细胞免疫的过程中,我们从日本的HIV病人体内分离出了S19-2 CTL克隆,发现该CTL克隆能够很好的杀伤结合有nef138-10多肽的靶细胞,证明该CTL克隆能够行使效应T细胞功能。通过TCR基因测序分析,我们发现S19-2 T细胞表面表达一类特殊的Vδ/VβTCR。从细胞水平和分子水平,我们系统地研究了Vδ/VβTCR+ CTL克隆S19-2的受体结合特性。应用SPR技术我们发现S19-2 Vδ/VβTCR结合配体时具有高亲和力和长半衰期的特性,而这两个特性被认为与T细胞的激活能力是密切正比相关的。
通过解析S19-2 Vδ/VβTCR与配体pHLA的复合物结构,我们发现S19-2采取了独特的CDR环足迹去接触pHLA,尤其是CDR3δ并不与多肽相互作用,而是占据了HLAα1螺旋上以前不被接触的“高地区”。这种结合方式使得S19-2能以最大接触面积去结合配体,从而表现出高亲和力和难解离的特性。我们通过丙氨酸突变扫描实验验证CDR3δ在结合过程中起的重要作用。
通过比较pHLA和TCR各自的自由状态和结合状态下的结构,我们发现在两者的接触界面发生了很大的构象调整。这种构象调整是基于S19-2独特的CDR环足迹分布才发生的,并且是两者相互协同作用的结果。
这里,我们提出TCR的CDR3环不仅是用来识别多肽,而且也可以作用于MHCα的α螺旋,使得TCR具有高亲和力和难解离的结合特性。这种结合策略对于CTLs控制HW病人体内的病毒复制将是有益的。
另外,我们发现S19-2 CTL克隆不能有效地杀伤结合有2F突变肽的靶细胞。我们通过解析S19-2与结合有2F突变肽的MHC的复合物结构,并与野生型的复合物结构相互比较,阐释了2F突变肽发生免疫逃逸的分子机制。我们发现结合前后,2F突变肽的移动距离比野生型多肽要小,即构象调整要小。这种不同的构象调整是由于多肽N端锚定残基附近的水分子分布不一样,引起水分子介导的氢键网络的有无差异所导致的。进一步细致分析TCR与pHLA的相互作用,我们发现2F突变肽复合物里CDR3β环与多肽F6残基的原子间范德华力接触数目,不如在野生型多肽复合物里的多,这种结合的不紧密正好解释了为何S19-2弱识别2F突变肽。
而在研究nef138-8特异性的T细胞免疫时,我们发现了能够广谱性应答HIVNef蛋白来源的免疫优势表位及其免疫逃逸表位的公共TCRs(H25-11和TD08)。并通过活病毒ELISPOT实验表明这种具有广谱性免疫应答能力的公共TCR对HIV病毒感染尤其是早期感染的控制是很重要的。此类公共TCR的发现,对我们开展AIDS的免疫治疗策略和疫苗设计是具有重要意义的,为之提供了一个新方向。
除了研究TCR与pMHC的相互作用,我们还开展了辅助受体CD8与pMHC的结合特性研究。我们通过分析一个晶体不对称单元里的两个hCD8αα/HLA-A*2402复合物结构,发现hCD8αα结合HLA-A24存在两种不同的结合方式(“拉向”或是“推离”)。而在之前报道的人和鼠的CD8/pMHC复合物结构,我们也发现了类似的“拉向”或“推离”结合方式,由此,我们提出hCD8αα结合HLA-A24时具有一定的可塑性,而这种可塑性有利于CD8行使它的辅助受体功能(增加亲和力),适应不同TCR与pMHC结合的构象调整。并且这种可塑性不会影响TCR识别的特异性,因为hCD8αα采用不同的结合方式结合HLA-A24时,并没有引起多肽的构象变化。
流感病毒的HA蛋白负责流感病毒的入侵过程,所以HA蛋白的受体结合特性对于流感病毒的预防和控制是有重大指导意义的。最近,2009大流感病毒发生的D225G氨基酸突变现象被发现与流感重症和致死性有关。而且该D225G突变也存在于1918大流感病毒中。我们应用杆状病毒真核表达系统,获得可溶性的1918和2009大流感的HA蛋白,并使用SPR技术研究了18H1和09H1及其D225G突变体的受体结合特性。我们发现18H1和09H1具有极其相似的结合特性,野生型18H1和09H1都偏好性地结合人源受体,而D225G突变体都具有双受体特异性结合能力(既能结合人源受体也能结合禽源受体)。这里,我们通过解析09H1和18H1及其D225G突变体与人源/禽源受体类似物的复合物结构,揭示了D225G如何引起受体结合特性的改变,主要是由于D变成G,导致225位与K222形成的盐桥相互作用缺失,从而使得220环变得很柔性,便于Q226与禽源受体的相互作用。
最后,结合以前报道的有关H1亚型HA蛋白的受体结合特性的数据,我们总结出影响H1亚型HA蛋白受体结合特性的关键氨基酸,除去与底部氨基酸(Y98,W153,H183和Y195)和130环(V135,T136,A137)的保守相互作用,有四个氨基酸是影响受体结合特性的关键氨基酸,190位,222位,225位,226位。这四位氨基酸的不同组合最终决定H1亚型HA蛋白的受体结合特性。