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乙型肝炎病毒(HBV)严重威胁着人类的健康,对HBV的研究具有重大的意义。本文中,我们构建了一个重组egfp基因和1.3倍HBV基因组的杆状病毒系统:建立了一种基于两轮PCR和MASA液相芯片技术的HBV基因分型方法;构建了一个可通过网络访问的HBV数据库。
第一章:文献综述。概括介绍了乙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒的细胞模型、乙型肝炎病毒的基因型、MASA液相芯片技术以及乙型肝炎病毒数据库。并在本章最后介绍了本论文的研究目的、内容和意义。
第二章:本章构建了一个重组egfp基因和1.3倍HBV基因组的杆状病毒复制系统。在这个系统中,egfp基因带有两个启动子:在昆虫细胞中工作的op166启动子和在哺乳动物细胞中工作的CMV启动子。它们都是早期启动子,有利于在早期检测到转染、感染或转导的情况。1.3倍HBV基因组是通过设计两对引物分别扩增出nt1044-3215/1-248和nt248-1982两个片段,然后将这两个片段通过nt248位的XbaI位点连接成1.3倍的基因组。这个基因组来源于中国的一株病毒株,基因型为C型。通过构建一系列中间载体,作者成功构建了这个重组杆状病毒系统,在转导HepG2细胞后,不仅能够检测到荧光表达,还能够在上清中检测到HBV的抗原和HBV DNA。
第三章:HBV基因分型方法的建立。根据HBV8个基因型的特点,设计出基因型特异性的引物和探针,利用两轮PCR方法和MASA液相芯片技术,建立了一种快速的基因分型方法。这种方法可以同时检测HBV的8个基因型,用已知基因型的样本对这种方法进行验证显示它的特异性很好。灵敏度分析实验也表明这种方法具有很高的灵敏度,可以对含有10个拷贝以上的样本进行有效的分型。用这种方法对28份来自咸宁市疾病预防控制中心的临床血清样本进行了基因分型,结果显示,78.6%为B型(22/28),21.4%为C型(6/28),没有发现其它基因型,所得的结果和有关研究报道的相似。
第四章:本章使用结构化查询语言MySQL、嵌入式超文本处理语言PHP和编辑语言perl/bioperl建立一个综合的可通过网络访问的HBV数据库(HBVDB),包括HBV的序列数据库(SeqDB)、HBV的临床数据库(ClinicaIDB)和宿主基因数据库(HostDB)。目前完成了SeqDB数据库的构建。构建好SeqDB可通过如下地址进行访问:http:H159.226.126.177/hbvdb。