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绿色荧光蛋白不仅能够发出稳定的荧光,而且其生色团的成熟是一个自催化的过程,不需要任何的辅因子。因此,绿色荧光蛋白生色团的成熟机理不仅是一个重要而有趣的理论问题,还可以帮助人们合成出成熟速率更快、荧光更稳定、颜色更亮的荧光蛋白变体,具有广泛的应用价值。本论文主要利用密度泛函理论(DFT)和量子力学/分子力学相结合的方法(QM/MM),通过理论计算了绿色荧光蛋白生色团的成熟机理。主要研究内容可归纳为以下几个方面: 1.本文首先采用密度泛函理论在孤立的活性中心模型下对绿色荧光蛋白生色团成熟过程中的环化反应机理进行了研究。计算结果表明相对于夺去Tyr66α碳上的质子来启动成环,夺去Gly67酰胺氮上的质子来启动成环是势垒比较低的一条反应路径。环化产物在热力学上是吸热的,Arg96起稳定烯醇式结构的作用,Glu222起碱的作用。 2.本文随后运用了分子动力学模拟和QM/MM的方法,进一步研究了在蛋白环境下的环化反应机理。动力学的模拟结果表明,Gly67酰胺氮和Glu222的羧酸盐之间没有氢键网络,证明从Gly67酰胺氮上夺去质子是不可能的,而Tyr66α碳和Glu222之间存在一条氢键网络,与实验结果一致。此外,Gly67酰胺氮和Set65的羰基碳之间的平均距离是3.16A,小于其范德华半径之和(3.25A),可见Gly67酰胺氮和Ser65的羰基碳足够靠近,成环过程很有可能是通过Gly67的酰胺氮直接进攻Ser65的羰基碳原子来完成,而不是由夺去Tyr66α碳上的质子或Gly67酰胺氮上的质子来启动。 3.本文用分子动力学模拟和QM/MM的方法研究了绿色荧光蛋白生色团成熟过程中脱水反应机理。本文分两步计算了脱水反应的逆反应过程,其中第一步为羟基负离子进攻生色团的五元杂环,第二步为Arg96胍盐上的质子转移Tyr66的β碳上。计算结果表明Glu222夺去W24上的质子的过程和羟基负离子进攻五元杂环上碳的过程是协同过程,Arg96胍盐上的质子转移到Tyr66β碳上的过程是反应的决速步骤,整个脱水反应在热力学上是一个放热的过程。 此外本文还介绍了博士阶段完成的其他工作,即采用完全活化空间自洽场的二阶微扰方法(CASPT2)扫描了二氧化碳在多个电子态(1A1(1∑+g),1B2,3B2)上的势能面。计算结果表明1B2和3B2态之间没有交叉点。而1B2和3A2态之间存在交叉点,该交叉点位于CO+O(3P)的解离极限0.23eV之上,与实验观测到的能量(0.27eV)是相吻合的。这说明氧原子O(1D)和一氧化碳Co(X1∑+g,v=0)结合的机理是通过3A2态和1B2态的交叉点到达产物CO(X1∑+g,v,J)+o(3P)。