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研究目的：
探究注射用血栓通(XST)抗血小板聚集的生物力药理学机制。
研究内容：
1.XST对血栓形成及血流状态的影响
50只雄性SD大鼠随机分为5组，即正常组，模型组，阳性对照肝素钠组（1000U·kg-1）XST低、高剂量组(50、150mg·kg-1)。连续腹腔注射给药10d，正常及模型组大鼠给予等体积生理盐水：在第7天给药1h后尾静脉注射1mg.kg-1角叉菜胶建立大鼠血栓模型。造模后2h，6h，24h，48h测量大鼠黑尾长度;以Vevo2100小动物超声成像系统检测人鼠颈总动脉血管内径、血流速度等指标并计算其血流量及血流剪切率；以激光散斑血流成像系统检测大鼠股、尾部微循环血流灌注量;以血小板聚集仪检测血小板最大聚集率;以HE染色法观察大鼠尾部组织及血管病理学变化;以Western blot法检测血小板Piezol蛋白含量。
2.高剪切条件XST划vWF介导的血小板粘附及滚动的影响
建立高剪切流动条件下vWF介导的瓶小板粘附及滚动模型。选择70μg.mL-1的vWF铺被微流通道。正常大鼠腹腔注射3.0％戊巴比妥钠进行麻醉，腹主动脉取血后加入3.8％枸橼酸钠(抗凝比例1：9)抗凝。在Bioflux48孔板的进液孔加入270μL伞m及30mL XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)，溶剂对照组加入等量生理盐水，施加3000S-1剪切率灌注通道10min。吸弃剩余全血，各孔加入PBS润洗3次。然后往进液孔中加入含有100μL各浓度药物的1mL HBSS缓冲液，施加1000S-1剪切率冲洗通道至红细胞不可见。然后施加6000S-1剪切率，利用全自动活细胞成像系统(Brightfield采集模块)实时观察并记录血小板滚动情况。
3.不同剪切条件下XST对血小板聚集的影响
正常大鼠腹主动脉取血后制备PRP，使川Wyrode-血小板缓冲液将PRP调整至0.5×108/mL。将PRP与Calcein-AM。荧光染液室温避光孵育1h后将载有荧光染液的PRP分别与XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)、GsMTx-4抑制剂(2.5μmol·L-1)、Yodal激动剂(25μmol·L-1)、XST联合Yodal(0.15g·L-1+25μmol·L-1、0.6g·L-1+25μmol·L-1)以及溶剂对照组给予相同体积量的生理盐水孵育5min。将孵育好的PRP加入提前铺被好胶原(40μg·mL-1)的Bioflux48孔板内，采用Bioflux1000z控剪应力微流培养系统施加400S-1，1000S-1，2000S-1，4000S-1，8000S-1剪切率，每种剪切率时间设为5min，利用全自动活细胞成像系统(FITC荧光采集模块)实时观察并记录血小板聚集情况。
4.流动条件XST对血小扳Ca2+内流的影响
正常大鼠腹主动脉取血后制备WP，将WP与Fluo-3AM荧光染液37℃避光孵育45min。洗去多余荧光染液并调整WP至3×108/mL。将载有荧光染液的WP加入预先铺被胶原的Bioflux24孔扳的A孔，将配制好的含有1mmol·L-1Ca2+的各组药物，即XST(0.15g·L-1)、GsMTx-4抑制剂(2.5μmol·L-1)、Yoda1激动剂(25μmol·L-1)、XST联合Yodal(0.15g·L-1+25μmol·L-1)以及溶剂对照组给予等体积生理盐水，加入相应的B孔内。利用Bioflux1000z控剪应力微流系统将A孔中的WP悬液以0.066psi的压力(相当于200S-1剪切速率)灌注到微流体通道中，压力持续2min。停止对A孔施加压力后，在B孔处施加0.165psi的压力(相当于1000S-1剪切速率)，将B孔中的药物灌注到微流通道内，压力持续10min。通过荧光显微镜和全自动成像系统(波长FITC：曝光时间400ms)每30s捕获血小板内Ca2+的荧光显微图像。
5.不同条件下XST对血小板Piezo1相关蛋白表达的影响
静态条件下：将大鼠WP与XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)、GsMTx-4(2.5μmol·L-1)、Yodal(25μmol·L-1)以及盐水预孵育WP10min后，加入ADP(10μmol·L-1)诱导血小板活化30min。裂解血小板，提取血小板总蛋白，利用Western blot法检测血小板Piezol蛋白的表达。
流动条件下：将大鼠WP与XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)、GsMTx-4(2.5μmol·L-1)、Yodal(25μmol·L-1)、XST联合Yodal(0.15g·L-1+25μmol·L-1、0.6g·L-1+25μmol·L-1)以及盐水预先孵育10min，除整除对照组外，利用Bioflux1000z施加1000S-1、4000S-1及10000S-1剪切诱导血小板活化30min。裂解血小板，提取血小板总蛋白，利用Western blot法检测血小扳Piezol蛋白、Calpain-2蛋白、Talinl蛋白及Vinculin蛋白的表达。
研究结果：
1.XST对血栓形成及血流状态的影响
结果显示，XST可抑制角叉菜胶绣导的大鼠尾部血栓形成，明显缩短黑尾长度(P＜0.05)；与模型组相比，XSTL组可明显增高大鼠颈总动脉血流量(P＜0.05);XSTH组可明显改善大鼠尾部微循环血流灌注量(P＜0.05)；XSTH组可明显抑制血小板聚集率(P＜0.05)：XSTL剂量组可明显增多血小扳Piezol蛋白表达(P＜0.01)。
2.高剪切流动条件下XST对vWF介导的血小板粘附及流动的影响
在高剪切条件下，随着vWF浓度增大，血小板粘附增多。选用70μg·mL-1浓度的vWF作为评价XST对血小板粘附及及滚动的影响。
结果显示，与溶剂对照组相比，XST对vWF介导的血小板粘附及滚动无明显影响。
3.不同剪切流动条件下XST对血小板聚集的影响
结果显示，血小板聚集率随剪切率增大而增大。与溶剂对照组相比，XST显著抑制剪切诱导血小板聚集，并呈剂量依赖关系;量化统计分析结果显示，XSTL及XSTH组均可明显降低在生理剪切速率为1000s-1-2000s-1和病理性高剪切速率为4000s-1-8000s-1下形成的聚集体的数量和聚集面积(P＜0.05或P＜0.01);与Yodal纰相比，Yodal联合XST-L及XST-H组可明显抑制血小板聚集，平均抑制率分别达到66.37％及78.63％(P＜0.01)。
4.流动条件下XST对血小板Ca2+内流的影响
在剪切速率为1000s-1条件下，各组Ca2+荧光强度随时间累积逐渐增加。动脉剪切1000s-1导致血小板中Ca2+内流持续增加至93.72％。与模型组相比，GsMTx-4和XST组血小板内Ca2+荧光强度明显减少了32.04％及25.31％(P＜0.01)，而Yodal组Ca2+荧光强度增强了58.04％。与Yodal组相比，Yodal联合XST组血小板Ca2+荧光强度明显降低了39.91％(P＜0.05)。
5.不同条件下XST对血小板Piezol相关蛋白的影响
静态条件下，XST对血小板Piezol蛋白的表达无明显影响。
在1000s-1、4000s-1及10000s-1剪应条件下，血小板Piezol蛋门表达量与静态相比明显增多;而药物对Piezol蛋白的表达无明显影响。在4000s-1剪应力下，用GsMTx-4、Yodal及XST处理过血小板Calpain-2及Vinculin蛋白无明显变化。高剪切流动条件下检测到血小板Talinl被裂解为230kDa及190kDa分子量。经Yodal处理后，血小板230kDa Talinl蛋白量显著降低32％(P＜0.01)：190kDa Talin1蛋白量占著增加64％(P＜0.01)。而XST(0.15g·L-1)联合Yodal组明显降低了230kDa Talinl的表达(P＜0.01)，XST(0.6g·L-1)联合Yodal处理显著降低了190kDa Talinl的表达(P＜0.05)
研究结论：
1.XS3可明显抑制血小板活化聚集，改善大鼠血流状态维持血流正常力学环境，从而发挥抗血栓的效果：
2.XST对高剪切力条件下vwF介导的血小板粘附及滚动无明显影响，这提示XST抗剪切诱导血小板聚集机制可能不必通过vWF-GPlbot途径发挥作用;
3.XST可明湿抑制剪切诱导血小板聚集，其作用机制可能与抑制血小板机械力离子通道Piezol蛋白的活化并抑制Ca2+内流相关;
4.XST抑制了Piezol的活化并减少了Ca2+内流，从而影响到了Calpain-2的活性，使得其切割Talinl的功能减弱，Talinl分子不能有效募集至血小板整联蛋白GPIlblIIa，从而影响血小板聚集及血栓形成。
探究注射用血栓通(XST)抗血小板聚集的生物力药理学机制。
研究内容：
1.XST对血栓形成及血流状态的影响
50只雄性SD大鼠随机分为5组，即正常组，模型组，阳性对照肝素钠组（1000U·kg-1）XST低、高剂量组(50、150mg·kg-1)。连续腹腔注射给药10d，正常及模型组大鼠给予等体积生理盐水：在第7天给药1h后尾静脉注射1mg.kg-1角叉菜胶建立大鼠血栓模型。造模后2h，6h，24h，48h测量大鼠黑尾长度;以Vevo2100小动物超声成像系统检测人鼠颈总动脉血管内径、血流速度等指标并计算其血流量及血流剪切率；以激光散斑血流成像系统检测大鼠股、尾部微循环血流灌注量;以血小板聚集仪检测血小板最大聚集率;以HE染色法观察大鼠尾部组织及血管病理学变化;以Western blot法检测血小板Piezol蛋白含量。
2.高剪切条件XST划vWF介导的血小板粘附及滚动的影响
建立高剪切流动条件下vWF介导的瓶小板粘附及滚动模型。选择70μg.mL-1的vWF铺被微流通道。正常大鼠腹腔注射3.0％戊巴比妥钠进行麻醉，腹主动脉取血后加入3.8％枸橼酸钠(抗凝比例1：9)抗凝。在Bioflux48孔板的进液孔加入270μL伞m及30mL XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)，溶剂对照组加入等量生理盐水，施加3000S-1剪切率灌注通道10min。吸弃剩余全血，各孔加入PBS润洗3次。然后往进液孔中加入含有100μL各浓度药物的1mL HBSS缓冲液，施加1000S-1剪切率冲洗通道至红细胞不可见。然后施加6000S-1剪切率，利用全自动活细胞成像系统(Brightfield采集模块)实时观察并记录血小板滚动情况。
3.不同剪切条件下XST对血小板聚集的影响
正常大鼠腹主动脉取血后制备PRP，使川Wyrode-血小板缓冲液将PRP调整至0.5×108/mL。将PRP与Calcein-AM。荧光染液室温避光孵育1h后将载有荧光染液的PRP分别与XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)、GsMTx-4抑制剂(2.5μmol·L-1)、Yodal激动剂(25μmol·L-1)、XST联合Yodal(0.15g·L-1+25μmol·L-1、0.6g·L-1+25μmol·L-1)以及溶剂对照组给予相同体积量的生理盐水孵育5min。将孵育好的PRP加入提前铺被好胶原(40μg·mL-1)的Bioflux48孔板内，采用Bioflux1000z控剪应力微流培养系统施加400S-1，1000S-1，2000S-1，4000S-1，8000S-1剪切率，每种剪切率时间设为5min，利用全自动活细胞成像系统(FITC荧光采集模块)实时观察并记录血小板聚集情况。
4.流动条件XST对血小扳Ca2+内流的影响
正常大鼠腹主动脉取血后制备WP，将WP与Fluo-3AM荧光染液37℃避光孵育45min。洗去多余荧光染液并调整WP至3×108/mL。将载有荧光染液的WP加入预先铺被胶原的Bioflux24孔扳的A孔，将配制好的含有1mmol·L-1Ca2+的各组药物，即XST(0.15g·L-1)、GsMTx-4抑制剂(2.5μmol·L-1)、Yoda1激动剂(25μmol·L-1)、XST联合Yodal(0.15g·L-1+25μmol·L-1)以及溶剂对照组给予等体积生理盐水，加入相应的B孔内。利用Bioflux1000z控剪应力微流系统将A孔中的WP悬液以0.066psi的压力(相当于200S-1剪切速率)灌注到微流体通道中，压力持续2min。停止对A孔施加压力后，在B孔处施加0.165psi的压力(相当于1000S-1剪切速率)，将B孔中的药物灌注到微流通道内，压力持续10min。通过荧光显微镜和全自动成像系统(波长FITC：曝光时间400ms)每30s捕获血小板内Ca2+的荧光显微图像。
5.不同条件下XST对血小板Piezo1相关蛋白表达的影响
静态条件下：将大鼠WP与XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)、GsMTx-4(2.5μmol·L-1)、Yodal(25μmol·L-1)以及盐水预孵育WP10min后，加入ADP(10μmol·L-1)诱导血小板活化30min。裂解血小板，提取血小板总蛋白，利用Western blot法检测血小板Piezol蛋白的表达。
流动条件下：将大鼠WP与XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)、GsMTx-4(2.5μmol·L-1)、Yodal(25μmol·L-1)、XST联合Yodal(0.15g·L-1+25μmol·L-1、0.6g·L-1+25μmol·L-1)以及盐水预先孵育10min，除整除对照组外，利用Bioflux1000z施加1000S-1、4000S-1及10000S-1剪切诱导血小板活化30min。裂解血小板，提取血小板总蛋白，利用Western blot法检测血小扳Piezol蛋白、Calpain-2蛋白、Talinl蛋白及Vinculin蛋白的表达。
研究结果：
1.XST对血栓形成及血流状态的影响
结果显示，XST可抑制角叉菜胶绣导的大鼠尾部血栓形成，明显缩短黑尾长度(P＜0.05)；与模型组相比，XSTL组可明显增高大鼠颈总动脉血流量(P＜0.05);XSTH组可明显改善大鼠尾部微循环血流灌注量(P＜0.05)；XSTH组可明显抑制血小板聚集率(P＜0.05)：XSTL剂量组可明显增多血小扳Piezol蛋白表达(P＜0.01)。
2.高剪切流动条件下XST对vWF介导的血小板粘附及流动的影响
在高剪切条件下，随着vWF浓度增大，血小板粘附增多。选用70μg·mL-1浓度的vWF作为评价XST对血小板粘附及及滚动的影响。
结果显示，与溶剂对照组相比，XST对vWF介导的血小板粘附及滚动无明显影响。
3.不同剪切流动条件下XST对血小板聚集的影响
结果显示，血小板聚集率随剪切率增大而增大。与溶剂对照组相比，XST显著抑制剪切诱导血小板聚集，并呈剂量依赖关系;量化统计分析结果显示，XSTL及XSTH组均可明显降低在生理剪切速率为1000s-1-2000s-1和病理性高剪切速率为4000s-1-8000s-1下形成的聚集体的数量和聚集面积(P＜0.05或P＜0.01);与Yodal纰相比，Yodal联合XST-L及XST-H组可明显抑制血小板聚集，平均抑制率分别达到66.37％及78.63％(P＜0.01)。
4.流动条件下XST对血小板Ca2+内流的影响
在剪切速率为1000s-1条件下，各组Ca2+荧光强度随时间累积逐渐增加。动脉剪切1000s-1导致血小板中Ca2+内流持续增加至93.72％。与模型组相比，GsMTx-4和XST组血小板内Ca2+荧光强度明显减少了32.04％及25.31％(P＜0.01)，而Yodal组Ca2+荧光强度增强了58.04％。与Yodal组相比，Yodal联合XST组血小板Ca2+荧光强度明显降低了39.91％(P＜0.05)。
5.不同条件下XST对血小板Piezol相关蛋白的影响
静态条件下，XST对血小板Piezol蛋白的表达无明显影响。
在1000s-1、4000s-1及10000s-1剪应条件下，血小板Piezol蛋门表达量与静态相比明显增多;而药物对Piezol蛋白的表达无明显影响。在4000s-1剪应力下，用GsMTx-4、Yodal及XST处理过血小板Calpain-2及Vinculin蛋白无明显变化。高剪切流动条件下检测到血小板Talinl被裂解为230kDa及190kDa分子量。经Yodal处理后，血小板230kDa Talinl蛋白量显著降低32％(P＜0.01)：190kDa Talin1蛋白量占著增加64％(P＜0.01)。而XST(0.15g·L-1)联合Yodal组明显降低了230kDa Talinl的表达(P＜0.01)，XST(0.6g·L-1)联合Yodal处理显著降低了190kDa Talinl的表达(P＜0.05)
研究结论：
1.XS3可明显抑制血小板活化聚集，改善大鼠血流状态维持血流正常力学环境，从而发挥抗血栓的效果：
2.XST对高剪切力条件下vwF介导的血小板粘附及滚动无明显影响，这提示XST抗剪切诱导血小板聚集机制可能不必通过vWF-GPlbot途径发挥作用;
3.XST可明湿抑制剪切诱导血小板聚集，其作用机制可能与抑制血小板机械力离子通道Piezol蛋白的活化并抑制Ca2+内流相关;
4.XST抑制了Piezol的活化并减少了Ca2+内流，从而影响到了Calpain-2的活性，使得其切割Talinl的功能减弱，Talinl分子不能有效募集至血小板整联蛋白GPIlblIIa，从而影响血小板聚集及血栓形成。