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背景及目的：
本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。
方法和内容：
1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究
(1)建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解(RRMS)动物模型和继发进展(SPMS)动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙lmg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观N4,鼠的状态变化。
(2)砌WS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达
2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究
(1)分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1×106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。
(2)体外培养小鼠巨噬细胞株Raw264.7311小鼠小胶质细胞株BV2,并且体外分离小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)。分别以DHA1,49M为给药低,高剂量和LPS50ng/ml为造模浓度,细胞经过药物处理24h。首先,RT-PCR(Reverse Transcription.Polymerase Chain Reaction)的方法在转录水平上检测Raw264.7和PM细胞中负性免疫共刺激分子PDL1的表达;间接免疫荧光技术检测Raw264.7,BV2和PM三种细胞表面免疫共刺激分子PDL1的蛋白表达水平;采用人外周血白血病T细胞JWkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,通过流式细胞技术检测在共培养体系中,DHA对JurkatT细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。
(3)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测CCL5的表达;ELISA法检测EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量;趋化实验中,ELISA法检测BV2培养上清中CCL5的含量;transwell法验检测CCL5对小胶质细胞趋化能力变化。
(4)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测AXL的表达;Western Blot法检测BV2细胞AXL的蛋白表达情况;吞噬试验中,先诱导PC12细胞凋亡,Annexin V-FITC双染法检钡UPC12细胞的凋亡率;间接免疫荧光方法检测BV2细胞对凋亡的PCI2宝m胞的吞噬能力,并且采用荧光显微镜观察BV2细胞对凋亡PC12细胞的吞噬情况。
3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究
(1)为了在分子机制水平上验证DHA对AXL的依赖性,我们使用AXL的阻断剂SGl7079(0.2μM)阻断AXL的激活,我们首先采用BV2细胞吞噬凋亡PC12细胞的方法检测BV2细胞吞噬能力的变化;transwell法验检沏JJCCL5对小鼠小胶质细胞BV2趋化能力变化;最后采用Jwkat T与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,间接免疫荧光法检测DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。
(2)Western Blot法检钡,,UBV2细胞经过DHA和LPS处理后AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达。在上述研究的基础上加入SGI7079作用后,同样检测AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达情况。
(3)BV2细胞用DHAl和4μM作用24h后,间接免疫荧光方法检测BV2细胞的PDL1,FOXP3,CYSE/F480的表达量,ELISA法检测BV2细胞上清中CCL5的含量,transwell法检测对BV2细胞的趋化能力。BV2细胞用IFN-β和STAT1阻断剂Fludarabine作用后,间接免疫荧光法检测CYSE+/F480+的表达量,Western Blot检测,UPhospho-STAT1,SOCS3,Total-AXL,Phospho-AXL的蛋白表达量。
结果：
1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究
模型验证:MOG35.55造模后,每日疾病评分逐渐增加;行为学步态等指标出现明确障碍。组织学水平和脊髓电镜超显微结构结果显示上伴随有髓鞘脱失。上述结果证明:EAE模型造模成功,满足用于药物评价的实验要求。
1.1 DHA在EAE小鼠中具有机能改善和神经保护的作用
RRMS动物模型药效验证:RRMS主要是发病的初期阶段,以中枢神经系统炎症为主并伴随有髓鞘脱失,因此,进行炎症损伤和神经保护检测。与EAE模型组相比,DHA各给药组和MET组能够改善EAE模型小鼠的技能活动障碍。并且在组织学水平上能够对髓鞘起到保护作用。在神经保护作用层面上,DHA中剂量效果明显优于MET组。
SPMS动物模型药效验证:SPMS是发病的后期,主要是少突胶质细胞失活而导致髓鞘大量的脱失,Olig2则是少突胶质细胞的活性标记物,因此通过检测Olig2的表达来反映少突胶质细胞的活性。与EAE模型组小鼠相比,DHA各给药组和MET组均能够改善EAE模型小鼠的机能活动障碍。组织学水平上,DHA各个剂量组和MET组均能显著提高Olig2的阳性表达率,并且DHA剂量组具有剂量依赖性。
1.2 DHA能够抑常URRMS4小鼠中枢神经系统炎症
H&E结果显示DHA和MET均能显著降低脑组织和脊髓组织中的炎症细胞浸润水平;DHA各个给药组和MET组均能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达,相反,抑炎因子IL-10、TGF-β的转录明显激活;同时,DHA重塑炎症反应平衡的活性具有显著的剂量依赖性,并且DHA中,高剂量组均优于MET组。
2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究
2.1 基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析
2.2 DHA自身免疫抗原递呈的药物活性研究
2.3 DHA对自身免疫炎性趋化的药物活性研究
2.4 DHA对自身免疫炎症原清除的活性研究
3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究
3.1 基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究
3.2 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究
3.3 DHA对炎症“促.抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探
结论：
1.DHA可以改善EAEd、鼠的运动机能障碍;并且在组织学水平上具有神经保护和调节炎症的作用,进一步缓解EAE模型小鼠的中枢神经系统炎症;
2.中枢神经系统巨噬细胞及小胶质细胞是DHA在EAE模型中的主要效应细胞,同时小胶质细胞中AXL、CCL5等相关炎症分子的变化构成7DHA发挥药效的主要分子基础;
3.DHA在中枢神经系统中对自身免疫性炎症的抗原递呈、炎症趋化、抗原清除发挥了系统而多样的调节活性,最终实现了自身免疫炎症反应的平衡重塑和髓鞘保护。分别总结如下:
(1)DHA可以调节抗原加工递呈过程,降低T细胞对自身抗原的高反应状态。促进免疫共抑制分子PDL1的表面表达,逆转中枢神经系统自身免疫性炎症的过激状态,重塑T细胞(Th17/Treg)炎症促抑平衡。
(2)DHA可以减少炎性趋化,降低CNS中炎性细胞的募集浸润水平。DHA能显著抑制炎性趋化因子CCL5的表达和分泌,减少炎症损伤部位炎性细胞的浸润,降低炎性细胞的运动趋化能力,进而延缓炎症损伤进展。
(3)DHA能够增加小胶质细胞对损伤髓鞘的有效清除,促进炎症进程的主动消散。DHA能够显著且特异性的上调吞噬受体AXL的表达,加强病灶内凋亡细胞碎片的清除能力,减少自身免疫炎症原的暴露,削弱炎症反应的诱发水平。
4.DHA对自身免疫炎症反应的调节活性聚焦于对AXL这一分子靶点的有效调控并依赖于“IFNAR-STAT1-SOCS3”信号通路的高水平活化状态。上述分子机制研究也为DHA治疗自身免疫炎症提供了病理选择性和药效特异性的初步实验提不。
本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。
方法和内容：
1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究
(1)建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解(RRMS)动物模型和继发进展(SPMS)动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙lmg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观N4,鼠的状态变化。
(2)砌WS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达
2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究
(1)分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1×106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。
(2)体外培养小鼠巨噬细胞株Raw264.7311小鼠小胶质细胞株BV2,并且体外分离小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)。分别以DHA1,49M为给药低,高剂量和LPS50ng/ml为造模浓度,细胞经过药物处理24h。首先,RT-PCR(Reverse Transcription.Polymerase Chain Reaction)的方法在转录水平上检测Raw264.7和PM细胞中负性免疫共刺激分子PDL1的表达;间接免疫荧光技术检测Raw264.7,BV2和PM三种细胞表面免疫共刺激分子PDL1的蛋白表达水平;采用人外周血白血病T细胞JWkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,通过流式细胞技术检测在共培养体系中,DHA对JurkatT细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。
(3)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测CCL5的表达;ELISA法检测EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量;趋化实验中,ELISA法检测BV2培养上清中CCL5的含量;transwell法验检测CCL5对小胶质细胞趋化能力变化。
(4)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测AXL的表达;Western Blot法检测BV2细胞AXL的蛋白表达情况;吞噬试验中,先诱导PC12细胞凋亡,Annexin V-FITC双染法检钡UPC12细胞的凋亡率;间接免疫荧光方法检测BV2细胞对凋亡的PCI2宝m胞的吞噬能力,并且采用荧光显微镜观察BV2细胞对凋亡PC12细胞的吞噬情况。
3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究
(1)为了在分子机制水平上验证DHA对AXL的依赖性,我们使用AXL的阻断剂SGl7079(0.2μM)阻断AXL的激活,我们首先采用BV2细胞吞噬凋亡PC12细胞的方法检测BV2细胞吞噬能力的变化;transwell法验检沏JJCCL5对小鼠小胶质细胞BV2趋化能力变化;最后采用Jwkat T与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,间接免疫荧光法检测DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。
(2)Western Blot法检钡,,UBV2细胞经过DHA和LPS处理后AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达。在上述研究的基础上加入SGI7079作用后,同样检测AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达情况。
(3)BV2细胞用DHAl和4μM作用24h后,间接免疫荧光方法检测BV2细胞的PDL1,FOXP3,CYSE/F480的表达量,ELISA法检测BV2细胞上清中CCL5的含量,transwell法检测对BV2细胞的趋化能力。BV2细胞用IFN-β和STAT1阻断剂Fludarabine作用后,间接免疫荧光法检测CYSE+/F480+的表达量,Western Blot检测,UPhospho-STAT1,SOCS3,Total-AXL,Phospho-AXL的蛋白表达量。
结果：
1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究
模型验证:MOG35.55造模后,每日疾病评分逐渐增加;行为学步态等指标出现明确障碍。组织学水平和脊髓电镜超显微结构结果显示上伴随有髓鞘脱失。上述结果证明:EAE模型造模成功,满足用于药物评价的实验要求。
1.1 DHA在EAE小鼠中具有机能改善和神经保护的作用
RRMS动物模型药效验证:RRMS主要是发病的初期阶段,以中枢神经系统炎症为主并伴随有髓鞘脱失,因此,进行炎症损伤和神经保护检测。与EAE模型组相比,DHA各给药组和MET组能够改善EAE模型小鼠的技能活动障碍。并且在组织学水平上能够对髓鞘起到保护作用。在神经保护作用层面上,DHA中剂量效果明显优于MET组。
SPMS动物模型药效验证:SPMS是发病的后期,主要是少突胶质细胞失活而导致髓鞘大量的脱失,Olig2则是少突胶质细胞的活性标记物,因此通过检测Olig2的表达来反映少突胶质细胞的活性。与EAE模型组小鼠相比,DHA各给药组和MET组均能够改善EAE模型小鼠的机能活动障碍。组织学水平上,DHA各个剂量组和MET组均能显著提高Olig2的阳性表达率,并且DHA剂量组具有剂量依赖性。
1.2 DHA能够抑常URRMS4小鼠中枢神经系统炎症
H&E结果显示DHA和MET均能显著降低脑组织和脊髓组织中的炎症细胞浸润水平;DHA各个给药组和MET组均能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达,相反,抑炎因子IL-10、TGF-β的转录明显激活;同时,DHA重塑炎症反应平衡的活性具有显著的剂量依赖性,并且DHA中,高剂量组均优于MET组。
2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究
2.1 基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析
2.2 DHA自身免疫抗原递呈的药物活性研究
2.3 DHA对自身免疫炎性趋化的药物活性研究
2.4 DHA对自身免疫炎症原清除的活性研究
3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究
3.1 基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究
3.2 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究
3.3 DHA对炎症“促.抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探
结论：
1.DHA可以改善EAEd、鼠的运动机能障碍;并且在组织学水平上具有神经保护和调节炎症的作用,进一步缓解EAE模型小鼠的中枢神经系统炎症;
2.中枢神经系统巨噬细胞及小胶质细胞是DHA在EAE模型中的主要效应细胞,同时小胶质细胞中AXL、CCL5等相关炎症分子的变化构成7DHA发挥药效的主要分子基础;
3.DHA在中枢神经系统中对自身免疫性炎症的抗原递呈、炎症趋化、抗原清除发挥了系统而多样的调节活性,最终实现了自身免疫炎症反应的平衡重塑和髓鞘保护。分别总结如下:
(1)DHA可以调节抗原加工递呈过程,降低T细胞对自身抗原的高反应状态。促进免疫共抑制分子PDL1的表面表达,逆转中枢神经系统自身免疫性炎症的过激状态,重塑T细胞(Th17/Treg)炎症促抑平衡。
(2)DHA可以减少炎性趋化,降低CNS中炎性细胞的募集浸润水平。DHA能显著抑制炎性趋化因子CCL5的表达和分泌,减少炎症损伤部位炎性细胞的浸润,降低炎性细胞的运动趋化能力,进而延缓炎症损伤进展。
(3)DHA能够增加小胶质细胞对损伤髓鞘的有效清除,促进炎症进程的主动消散。DHA能够显著且特异性的上调吞噬受体AXL的表达,加强病灶内凋亡细胞碎片的清除能力,减少自身免疫炎症原的暴露,削弱炎症反应的诱发水平。
4.DHA对自身免疫炎症反应的调节活性聚焦于对AXL这一分子靶点的有效调控并依赖于“IFNAR-STAT1-SOCS3”信号通路的高水平活化状态。上述分子机制研究也为DHA治疗自身免疫炎症提供了病理选择性和药效特异性的初步实验提不。