【摘 要】
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蛋白激酶Cα相互作用蛋白(protein interacting kinase，PICK1.)with Cα，是蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)的靶蛋白之一，也是在PKCα和突触后膜受体蛋白间起重要作用的衔
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蛋白激酶Cα相互作用蛋白(protein interacting kinase，PICK1.)with Cα，是蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)的靶蛋白之一，也是在PKCα和突触后膜受体蛋白间起重要作用的衔接蛋白，迄今为止已经发现PICK1和40多种蛋白相互作用，在突触可塑性、神经递质传递、外周神经感觉、细胞生长等方面均发挥重要作用。PICK1蛋白一般包含PDZ结构域、BAR结构域以及两个位于末端的酸性氨基酸区。 PDZ结构域作为一种重要的蛋白与蛋白相互作用的结构域，参与细胞内的许多重要的生理功能。本文围绕PICK1中PDZ结构域开展以下工作。首先将小鼠来源的PICK1中编码PDZ结构域基因序列及其C44/G，C46/G，C44，46/GG的PDZ突变基因，克隆至经改造的表达载体pETM-3C，并在E.coli BL21中进行表达，重组表达产物经Ni2+-NTA，PreScission Protease(PPase)酶切，Sephacryl S-200凝胶层析获得电泳纯的重组PDZ及其突变体蛋白。进一步利用还原与非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子排阻、荧光光谱、蛋白晶体衍射以H2O2氧化诱导等方法分析，结果显示氧化条件对PICK1_ PDZ结构域有明显的影响，可引起PICK1_PDZ结构域二聚化，介导二聚体形成的原因在于PDZ上Cys44，Cys46与对应的PDZ上相应位点形成链间二硫键，而且Cys44比Cys46对氧化条件更为敏感。另外，氧化引发的PDZ二聚化会明显削弱其与受体亚基GluR2及膜脂的结合。在细胞内氧化也可诱导PICK1蛋白通过Cys44与Cys46形成分子间的二硫键。这些结果提示，氧化-还原可能会是调节PICK1蛋白众多生理功能的一种机制。 其次将包含N端酸性区域以及PDZ结构域基因编码序列插入pET-gst载体，在此基础上，利用定点突变技术获得酸性区不同位点突变的NPDZ（包括PDZ结构域上游1-20氨基酸残基）(D4D6/AA，D8/A，Ei0E11/AA，D12/A，D8D12/AA)的重组子。转入E.coli BL21中进行表达，表达产物经GST-Sepharose4B亲和层析和PreScissionProtease(PPase)酶切，Sephacryl S-200凝胶层析获得了电泳纯的NPDZ及其突变体蛋白。利用荧光光谱以及蛋白脂质覆盖法进一步分析N端酸性区以及Ca2+对PDZ结构域脂质结合的影响，揭示N末端酸性氨基酸存在会显著削弱PDZ与脂质的结合，其中D8，D12天冬氨酸残基是引起NPDZ与脂结合的减弱的关键残基。另一方面Ca2+也可通过结合酸性氨基酸区域来增强NPDZ的脂结合能力。
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