云南大白口蘑遗传多样性和化学成分研究

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本文通过野外调查和文献查阅,较系统地研究了云南南部大白口蘑的物候、生境、子实体和分离菌丝的主要生物学特性。研究发现:大白口蘑菌丝具锁状联合,并根据其可以进行人工栽培等特点,可明确断定大白口蘑并非菌根菌;营养菌丝可产生厚垣孢子。大白口蘑厚垣孢子在菌丝上的着生方式绝大多数为顶生,卵圆形,大小为3~5×2.5~4μm。大白口蘑营养菌丝通过产生厚垣孢子,构成了生活史中的无性小循环,丰富了大白口蘑生活史的内容;并可为大白口蘑的繁育提供了更多的选择途径。 本文应用DALP技术对云南野生大白口蘑遗传多样性进行分析。筛选的5组引物在大白口蘑6个菌塘的56朵子实体中检测到202个位点,其中多态位点151个,多态位点百分比PPB为74.75%。6个菌塘总的观察等位基因数Na为1.7475;总的有效等位基因数Ne为1.4659;Nei’s基因多样性指数H为0.2722;总的Shannon多样性指数J为0.4053;菌塘总的基因多样性Ht为0.2705,菌塘内基因多样性性Hs为0.012,菌塘间基因分化系数Gst为0.9556,菌塘的遗传一致度平均为0.6861。结果表明大白口蘑遗传变异有95.56%发生在菌塘间,4.44%发生在菌塘内,即大白口蘑菌塘间存在较大的遗传变异,菌塘间的遗传距离与其地理分布距离呈明显的相关性。 以松口蘑子实体为外类群,对大白口蘑野生子实体及其组织分离菌丝进行ITS序列测序,通过DNAStar软件进行比较分析。结果表明大白口蘑ITS序列长度为589 bp,松茸ITS序列长度为601 bp,ITS1和ITS2呈现不同程度的种间遗传变异;ITS序列测定证实了大白口蘑野生子实体及其组织分离菌丝的同质性,并且ITS区序列在大白口蘑种内不同菌株间的变异程度很小,表明使用通用引物ITS4和ITS5,通过PCR扩增测序即可用于大白口蘑的种质鉴定。 再次应用DALP技术对7株分离得到的大自口蘑菌株遗传多样性进行分析。研究结果和UPGMA聚类分析与野生子实体的研究结果相似。即大白口蘑菌株间存在较大的遗传变异,菌株间的遗传距离与来源子实体的地理距离呈明显的正相关。实验结果还表明DALP是一种研究蕈菌遗传多样性和遗传结构的有效方法。本文采用溶剂提取法从大白口蘑子实体中萃取挥发油化学成分,采用GC-MS联机法分析,分离鉴定出21种化学成分,其中绝大多数为脂肪酸酯类化合物,相对含量52.05%。在这些脂肪酸酯类化合物中,生物体内常见的硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸多以乙酯或甲酯的形式存在,并且是主要成分,所有成分均为在大白口蘑子实体中报道。抗菌实验表明,大白口蘑挥发油成分不具抗菌活性。 通过系统溶剂分离法、两相溶剂萃取法、结晶法和层析法分离纯化大白口蘑子实体和菌丝体乙酸乙酯相样品,并运用红外光谱、核磁共振谱、质谱、薄层色谱等分析鉴定方法对5个分离物进行了结构分析鉴定。所有化合物均从大白口蘑中分离得到,其中有一个新化合物为神经酰胺类化合物。 大白口蘑HPLC指纹图谱的建立遵循化学指纹图谱的基本要求,经方法学验证稳定可靠,重复性强。利用分离得到的腺苷为标准品对大白口蘑7个菌株进行HPLC化合物含量测定,并将结果用SAS9.0对大白口蘑7个菌株进行Q-聚类分析。结果表明化合物含量在各菌株中存在很大差异:在聚类上,各菌株的化学成分含量与菌株来源子实体的地理距离和菌株间的遗传距离并无相关性。
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