论文部分内容阅读
真核蛋白往往需要翻译后的加工修饰才能具有完整的生物活性。原核表达系统虽然具备很多优点，但它不能对真核蛋白进行翻译后的各种加工修饰，因而在许多真核蛋白的表达方面受到限制。杆状病毒昆虫细胞表达系统是逐渐发展起来，并且在现阶段得到广泛应用的真核表达系统，它具有蛋白翻译后加工修饰的功能，从而能够形成与天然蛋白高度一致并且可溶的蛋白。目前，杆状病毒表达系统已被成功应用于多种研究领域，并且仍然处于不断改进与完善之中。
本实验室前期的研究中，在昆虫细胞中表达了禽流感病毒H5N1 HA1与小鼠IgG2a Fc片段的融合蛋白：HA1-wFc与HA1-mFc。其中，HA1-wFc将IgG Fc段补体Clq关键结合位点进行了突变，HA1-mFc同时将Clq关键结合位点和FcRn结合位点进行了突变，目的是进行FcRn介导的IgG胞转通路转运抗原的粘膜免疫研究。但融合蛋白始终以沉淀的形式聚集在细胞碎片中，无法进行后续的蛋白纯化以及动物免疫实验。本实验在前期研究的基础之上，分析得出其蛋白不可溶的原因与信号肽的缺失有关，从而构建了带有信号肽的基因片段的表达载体。利用杆状病毒昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac重新表达了两种融合蛋白，并选择合适方法进行了纯化。
融合蛋白的可溶性表达与纯化为今后以该种融合蛋白为抗原免疫小鼠，进行FcRn介导的IgG胞转通路转运抗原的粘膜免疫研究奠定了基础。本研究取得的主要结果如下：
1.建立了融合蛋白在昆虫细胞中的可溶性表达方法
通过在HA1-wFc基因片段上分别加入HA自身的信号肽和昆虫细胞可识别的蜂素信号肽，利用Bac-to-Bac表达系统在昆虫细胞中表达，找出了使目的蛋白可溶性表达的方法。结果，加入两种信号肽均可以使目的蛋白在昆虫细胞内实现可溶性表达，且表达量没有显著差异。
2.sHA1-wFc、sHA1-mFc融合蛋白的表达
使用分别带有HA自身信号肽的sHA1-wFc、sHA1-mFc融合蛋白基因的表达载体，转座得到相应的重组杆状病毒后，重组病毒感染High Five细胞获得表达，经SDS-PAGE及Western blot鉴定，目的蛋白大小约80KD，比预测的蛋白大小(66.4KD)略大，说明目的蛋白已糖基化。
3.sHA1-wFc、sHA1-mFc融合蛋白的纯化
利用杆状病毒昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac使两种融合蛋白sHA1-wFc、sHA1-mFc分别在昆虫细胞内获得了表达，并应用葡萄球菌蛋白A和His亲和层析法获得了纯化蛋白。