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针对缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤的心脏自身保护的研究是近年研究的热点,Zhao等[1]于2003年提出了缺血后处理(Ischemicpostconditioning,IPO)的概念,即缺血后持续再灌注前给予多次短暂再灌注及缺血处理,可减轻心肌再灌注损伤。由于其在临床上具有良好的应用前景而成为目前研究缺血/再灌注损伤的新策略。关于IPO具体的保护作用机制尚不清楚,众多研究表明,线粒体在IPO介导的心脏保护作用中起重要作用。
环氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)经细胞色素P450表氧化酶(Cytochrome P450epoxygenases,CYP450)代谢产物。近期研究发现上调CYP450/EET系统可减轻心肌缺血/再灌注损伤:我室前期工作发现CYP2J3/EET。系统上调可能是IPO独特的心脏保护机制之一。然而CYP450/EET系统是否通过改变线粒体功能而介导IPO的心脏保护作用尚不清楚。
目的:
本工作以原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia reoxygenation,H/R)损伤和缺氧后处理(hypoxia postconditioning,HPO)模型为对象,观察改变内源性CYP2J3/EET系统对HPO导致的心肌细胞线粒体功能变化的影响,证实缺氧后处理上调CYP2J3/EET系统是通过影响线粒体而发挥心脏脏保护作用。
方法:
采用消化贴壁法分离乳鼠原代心肌细胞,采用缺氧3h,复氧2h方法复制心肌细胞H/R模型。随机分为七组:对照组(CON)、模型组(H/R)、缺氧后处理组(HPO)、MS-PPOH组(MS-PPOH)、CYP2J3基因转染组(CYP2J3)、H/R+CYP2J3基因转染组(H/R+CYP2J3)、HPO+MS-PPOH组(HPO+MS-PPOH)。采用MTT检测心肌细胞存活率；采用RT-PCR检测CYP2J3mKNA的水平,采用Western-Blot检测CYP2J3蛋白的表达水平,采用高效液相色谱方法(Highpressure liquid chromatography,HPLC)检测心肌培养液11,12-环二十碳三烯酸(11,12-Epoxyeicosatrienoic Acid,11,12-EET)水平；采用酯化钙黄绿素(Calcein-AM)和氯化钴(CoCl2)共孵育的方法检测mPTP开放情况,采用线粒体膜电位探针5,5’6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazol-earbocyanineiodide(JC-1)染色检测线粒体膜电位,采用Hoechst染色和TUNEL检测心肌细胞凋亡率,采用Western-Blot检测心肌细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达.
结果：
(1)与H/R组比较,HPO组和H/R+2J3组心肌细胞存活率明显增加(P<0.01),CYP2J3mRNA(P<0.01)、CYP2J3蛋白(P<0.01)表达及11,12-EET(P<0.01)含量增加,而细胞色素P450表氧化酶抑制剂MS-PPOH削弱了HPO上述对心肌的作用。
(2)缺氧/复氧导致心肌细胞mPTP开放及而线粒体膜电位去极化；与H/R组比较,HPO组和H/R+CYP2J3组mPTP开放程度(P<0.01)下降,心肌细胞去极化的程度减轻(P<0.01)。
(3)缺氧/复氧导致心肌细胞凋亡；CON组(P<0.01)、HPO组(P<0.01)及H/R+CYP2J3组(P<0.01)心肌细胞凋亡率明显低于H/R组；与HPO组相比较,HPO+MS-PPOH组的心肌细胞凋亡率明显增高(P<0.01)。
(4)H/R组的Caspase-3表达高于(P<0.01)、HPO组(P<0.01)和H/R+CYP2J3组(P<0.05),而HPO+MS-PPOH组Caspase-3高于HPO组(P<0.05)；与CON组相比较,H/R组Bcl-2/Bax比值明显下降(P<0.01)；而与H/R组相比较,HPO组(P<0.05)和H/R十CYP2J3组(P<0.05)的比值升高；HPO+MS-PPOH组Bcl-2/Bax比值较HPO组降低(P<0.05)。
结论：
(1)HPO通过上调CYP2J3/EET系统而减轻mPTP开放程度以及线粒体膜电位去极化；
(2)HPO通过影响CYP2J3/EET系统而减少心肌细胞凋亡；
(3)HPO通过影响CYP2J3/EET系统抑制Caspase-3表达及提高Bcl-2/Bax比值。
综上所述,HPO上调CYP2J3/EET系统,后者可能通过降低mPTP开放及线粒体膜去极化程度,抑制Caspase-3表达及提高Bcl-2/Bax比值而减少心肌细胞凋亡,而发挥拮抗心肌缺血/再灌注损伤的心脏保护作用。