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背景和目的：
MALT淋巴瘤是来源于边缘带B细胞的结外低度恶性淋巴瘤,可由慢性感染或自身免疫疾病引起,也可由染色体易位导致的基因异常表达引起。前者应用抗生素或抗炎治疗可治愈或缓解,但后者尚无确切有效治疗方案,为难治性肿瘤。MALT淋巴瘤目前已知的染色体异常主要为t(1；14)易位引起BCL10高表达,t(11；18)易位形成API2-MALT1融合基因,以及t(14；18)易位导致MALT1高表达,这三种情况均伴有BCL10的异常高表达。BCL10基因为本课题组首先从t(1；14)染色体易位的MALT淋巴瘤中分离鉴定,并已构建出Eμ-BCL10转基因小鼠模型。本研究是以该转基因小鼠模型为基础,进一步研究MALT淋巴瘤发病的分子机理。
研究方法和结果：
1.制备Eμ-BCL10转基因纯合子小鼠
尽管我们在前期研究中发现Eμ-BCL10转基因杂合子小鼠(Tg+/-)均表现为MALT淋巴瘤前体细胞一边缘带B细胞的增生,但其中仅14％的小鼠在养殖2年左右发生肿瘤。本研究拟应用Eμ-BCL10转基因杂合子小鼠培育出纯合子小鼠(Tg+/+),期望能够增加BCL10转基因蛋白表达量,并提高肿瘤发病率。BCL10蛋白表达量增加与肿瘤表型的量效关系研究将有助于本课题关于BCL10高表达引起MALT淋巴瘤发病分子机制的研究。通过Southern Blot及Real time PCR法,我们成功筛选出Eμ-BCL10转基因纯合子小鼠,并以侧交实验进行验证。WesternBlot方法证实Tg+/+中BCL10转基因蛋白表达量约为Tg+/-的两倍。
2.BCL10高表达引起小鼠脾脏边缘带B细胞增生,这种增生与BCL10转基因蛋白表达量存在量效关系
通过小鼠脾脏HE染色、anti-B220免疫组化染色、边缘带特异性荧光染色及流式细胞仪分析脾脏B细胞构成,发现Eμ-BCL10转基因纯合子小鼠脾脏边缘带B细胞增生程度较杂合子小鼠更为显著。BCL10蛋白表达水平与边缘带B细胞增生程度之间呈现量效关系。
3.增生的边缘带B细胞具有抗凋亡特性,这种抗凋亡特性是由于caspase-8/caspase-3活性受到抑制引起
采用CD43和CD23荧光抗体染色小鼠脾细胞,并由流式细胞仪分选两种抗体染色双阴性的细胞,证明分选后细胞大于70％均为边缘带B细胞。将这种分选所得细胞在含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,每天用AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒检测活细胞比例:野生型小鼠的边缘带B细胞在培养约3天后基本全部死亡,但转基因杂合子小鼠边缘带B细胞约有30％可存活6天以上,而转基因纯合子小鼠边缘带B细胞有50％可存活6天以上。我们进一步用anti-IgM抗体诱导凋亡,结果发现anti-IgM可以诱导野生型小鼠的边缘带B细胞凋亡,但对于转基因小鼠边缘带B细胞,anti-IgM非但不能诱导其凋亡,反而增加了其抗凋亡能力。然后我们又进一步分析BCL10高表达引起边缘带B细胞抗凋亡的分子机理,分别使用R&D公司的Caspase-3,8,9 Colorimetric Assay Kit检测细胞裂解物中这三种caspase的活性以及Cell Technology公司的APOLOGIXTM Carboxyfluorescein(FAM)caspase detection kits检测活体边缘带B细胞内caspase-8,9的活性。结果均显示,caspase-8和caspase-3的活性均随BCL10蛋白表达量增高而被抑制,但capase-9活性不受影响。Western Blot分析边缘带B细胞裂解物中caspase-3活性裂解片段,也初步显示BCL10蛋白表达增加可抑制caspase-3的激活。
结论：
为探讨MALT淋巴瘤发病的分子机理,本研究在Eμ-BCL10转基因杂合子小鼠的基础上,成功制备出Eμ-BCL10转基因纯合子小鼠,并首次证明纯合子小鼠BCL10转基因蛋白表达量约为杂合子小鼠的两倍。首次发现随着BCL10转基因蛋白表达量增加,MALT淋巴瘤前体细胞一边缘带B细胞的体内增生与体外抗凋亡能力均明显增加,增加程度与BCL10蛋白表达水平呈量效关系。进一步的分子机理研究证明,BCL10高表达引起caspase-8活性受到抑制可能是MALT淋巴瘤发病的主要因为。