论文部分内容阅读
小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)是从着床前胚胎的内细胞团中分离获得的一种具有无限增殖能力和不同胚层分化能力的细胞。自从1981年首次建立小鼠多能性胚胎干细胞以来，人们一直在优化ESCs体外培养体系。目前为止存在以下几种具有代表性的培养体系：饲养层细胞/血清、血清/LIF、BMP4/LIF和2i/L(GSK3抑制剂CHIR99021，MEK1/2抑制剂PD0325901和LIF)。2i/L培养体系是目前使用最为广泛的一种ESCs培养体系，它主要通过经典的WNT，FGF/ERK和JAK/STAT3信号通路来调节ESCs的na?ve多能性。据报道WNT，FGF/ERK和JAK/STAT3信号通路中的任何两种信号通路的联合使用均足以维持胚胎干细胞的自我更新能力。然而，尚不清楚WNT，FGF/ERK和JAK/STAT3信号通路中是否存在一种信号通路的单独使用就可以维持ESCs的多能性和自我更新能力。
在本研究中，我们为了确定ESCs自我更新过程中哪个信号通路起关键的作用，重点探讨了JAK/STAT3信号通路。探究单独使用LIF能否维持小鼠胚胎干细胞的体外自我更新能力；同时建立LIF依赖性小鼠新型胚胎干细胞系(L-ESCs)；分析其多能性维持及嵌合体发育能力；揭示其基因表达特征、DNA甲基化水平和组蛋白修饰状态等，获得如下研究结果：
1.建立LIF依赖性胚胎干细胞(L-ESCs)
首先，我们以实验室已建立的新型胚胎干细胞(ASCs)和2i/L-ESCs为材料，ASCs和2i/L-ESCs用只含有LIF的培养液进行培养。结果显示，单独使用LIF可维持小鼠ESCs多能性，并建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系，我们将其命名为L-ESCs。而且L-ESCs具有与2i/L-ESCs类似的多能性特征，可贡献嵌合体胎儿的各个组织，并得到健康的嵌合体小鼠。下面的分子特征分析实验如未特殊说明均使用从2i/L-ESCs转换获得L-ESCs为材料开展实验研究。
2.L-ESCs的分子特征分析
通过转录组测序、全基因组DNA甲基化测序和组蛋白修饰等分析结果表明，我们获得的L-ESCs具有与2i/L-ESCs类似的多能性基因表达水平，而且从整体基因表达上，L-ESCs处于2i/L-ESCs和S/L-ESCs的中间状态；L-ESCs具有较高的整体DNA甲基化水平和印记基因DNA甲基化水平；同时，L-ESCs中整体H3K27me3水平比2i/L-ESCs和S/L-ESCs高。这表明L-ESCs具有与2i/L-ESCs和S/L-ESCs不同的基因表达水平、DNA甲基化水和组蛋白修饰状态。
3.DNA甲基化对L-ESCs多能性维持起重要的作用
为了研究DNA甲基化从ASCs和2i/L-ESCs向L-ESCs转换过程和L-ESCs自我更新过程中的作用，我们在ASCs和ESCs中分别敲除Dnmt3a和Dnmt3l后探讨向L-ESCs转变的过程。研究结果显示，Dnmt3a和Dnmt3l的缺失显著降低ASCs和2i/L-ESCs向L-ESCs转换效率；此外，我们把已建立的L-ESCs用DNA甲基转移酶抑制剂处理发现，抑制DNA甲基化水平后L-ESCs很难维持其自我更新能力；但是，DNA甲基转移酶抑制剂处理后的2i/L-ESCs多能性未受影响。以上结果说明，DNA甲基化对L-ESCs的获得和自我更新能力起重要的作用。
通过以上研究，我们单独使用LIF培养条件下获得了一种新型DNA甲基化水平较高的胚胎干细胞系，即L-ESCs。如此简单的ESCs体外培养体系将为ESCs的分子机制研究提供理论依据。
在本研究中，我们为了确定ESCs自我更新过程中哪个信号通路起关键的作用，重点探讨了JAK/STAT3信号通路。探究单独使用LIF能否维持小鼠胚胎干细胞的体外自我更新能力；同时建立LIF依赖性小鼠新型胚胎干细胞系(L-ESCs)；分析其多能性维持及嵌合体发育能力；揭示其基因表达特征、DNA甲基化水平和组蛋白修饰状态等，获得如下研究结果：
1.建立LIF依赖性胚胎干细胞(L-ESCs)
首先，我们以实验室已建立的新型胚胎干细胞(ASCs)和2i/L-ESCs为材料，ASCs和2i/L-ESCs用只含有LIF的培养液进行培养。结果显示，单独使用LIF可维持小鼠ESCs多能性，并建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系，我们将其命名为L-ESCs。而且L-ESCs具有与2i/L-ESCs类似的多能性特征，可贡献嵌合体胎儿的各个组织，并得到健康的嵌合体小鼠。下面的分子特征分析实验如未特殊说明均使用从2i/L-ESCs转换获得L-ESCs为材料开展实验研究。
2.L-ESCs的分子特征分析
通过转录组测序、全基因组DNA甲基化测序和组蛋白修饰等分析结果表明，我们获得的L-ESCs具有与2i/L-ESCs类似的多能性基因表达水平，而且从整体基因表达上，L-ESCs处于2i/L-ESCs和S/L-ESCs的中间状态；L-ESCs具有较高的整体DNA甲基化水平和印记基因DNA甲基化水平；同时，L-ESCs中整体H3K27me3水平比2i/L-ESCs和S/L-ESCs高。这表明L-ESCs具有与2i/L-ESCs和S/L-ESCs不同的基因表达水平、DNA甲基化水和组蛋白修饰状态。
3.DNA甲基化对L-ESCs多能性维持起重要的作用
为了研究DNA甲基化从ASCs和2i/L-ESCs向L-ESCs转换过程和L-ESCs自我更新过程中的作用，我们在ASCs和ESCs中分别敲除Dnmt3a和Dnmt3l后探讨向L-ESCs转变的过程。研究结果显示，Dnmt3a和Dnmt3l的缺失显著降低ASCs和2i/L-ESCs向L-ESCs转换效率；此外，我们把已建立的L-ESCs用DNA甲基转移酶抑制剂处理发现，抑制DNA甲基化水平后L-ESCs很难维持其自我更新能力；但是，DNA甲基转移酶抑制剂处理后的2i/L-ESCs多能性未受影响。以上结果说明，DNA甲基化对L-ESCs的获得和自我更新能力起重要的作用。
通过以上研究，我们单独使用LIF培养条件下获得了一种新型DNA甲基化水平较高的胚胎干细胞系，即L-ESCs。如此简单的ESCs体外培养体系将为ESCs的分子机制研究提供理论依据。