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本论文由两部分组成:第一部分是基于X-射线晶体学的纤溶酶原激活物抑制因子1 (PAI-1)的结构机理研究;第二部分是PAI-1的抑制剂发现及其抑制机制研究。 尿激酶系统(the urokinase plasminogen activator system，uPAsystem)由尿激酶uPA、尿激酶受体uPAR以及两个特异性抑制因子PAI-1(plasminogenactivator inhibitor-1)和PAI-2组成，它调控着许多重要的生理过程如纤维蛋白溶解(fibrinolysis)、细胞的粘附、侵染和转移等。PAI-1是uPA在体内的天然抑制剂，是丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族的重要成员。 在生理条件下，PAI-1在人体循环系统中只有纳摩尔的浓度，而且半衰期仅为1-2小时。在如此苛刻的条件下，PAI-1为何能够特异并且快速地识别uPA呢？尽管人们为此作了大量的生理生化研究，但目前仍缺乏二者相互作用的结构基础，究其原因主要是由于活性态PAI-1的不稳定而且易聚集导致对PAI-1的结晶异常困难。 在论文的第一部分中，我们利用X-射线晶体学技术，综合运用了定点突变和生物物理方法克服了PAI-1的不稳定及易聚集的问题并成功地获得了PAI-1∶uPAS195A的复合物晶体，解析了该复合物的结构。结构解析表明，PAI-1使用一个柔顺性较强的活性中心环(RCL)插入尿激酶催化口袋，从而能快速并特异地识别uPA。在此过程中，PAI-1 RCL与uPA活性中心的相互作用至关重要，它约占PAI-1与uPA总相互作用面积的64％。此外， uPA活性中心外部的loop，<中文标题>= 如37-loop和147-loop对PAI-1与uPA的相互结合也同样非常重要。本研究从 原子水平上揭示了PAI-1和uPA相互作用的结构机理，为人们对uPA系统的进一 步认识提供了结构基础。 在体内，PAI-1是纤溶系统的重要负调控因子，PAI-1水平的异常升高会使 溶血系统失调导致血栓形成。因此PAI-1被认为是抗血栓性疾病的重要药物作用 靶标。此外，PAI-1还通过介导血管新生（angiogenesis）、细胞增殖以及竞争结合 玻连蛋白(vitronectin)等生理过程参与了肿瘤的转移和粘附。因此PAI-1还是一 个重要的抗肿瘤药物作用靶标。目前PAI-1已经被美国临床肿瘤学会(ASCO) 确定为乳腺癌检测的首选标志物。由此，关于PAI-1抑制剂发现与设计的研究具 有十分重要的意义和应用前景。 在本论文第二部分中，我们开展了PAI-1抑制剂筛选的研究。我们从1600 个天然产物库中筛选获得一个PAI-1抑制剂——信筒子醌（embelin，图3-3）， IC50为1.62 μM。其3个结构类似物(Emb-d1，Emb-d2，Emb-d3，图3-3)对PAI-1 也具有相似的抑制活性。随后我们在分子和细胞水平上对该化合物进行了深入的 研究。在分子水平上，我们通过基于表面等离子共振(SPR)技术的BIAcore3000 实验确证，embelin能浓度依赖性地与PAI-1蛋白结合，KD值为2.09 μM。接着我 们通过SDS-PAGE实验发现，embelin能显著抑制PAI- 1-uPA共价复合物的形成， 并诱导PAI-1转换成底物态形式。然后，我们还通过自动纤维蛋白降解实验发现， embelin及其结构类似物能显著抑制纤维蛋白凝块的形成。此外，利用基于ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)技术的细胞损伤修复实验，我们发现 embelin及其结构类似物能强烈抑制HepG2细胞的转移能力。同时本研究还通过 X-射线晶体学方法，解析了PAI-1/embelin复合物的晶体结构，结合定点突变技 术，我们发现embelin作用于PAI-1蛋白上由α-helixD、E及F组成的口袋，并 与它们发生氢键相互作用。我们猜测该相互作用阻碍了PAI-1 RCL的插入，从而 诱导PAI-1转换成底物态形式，最终阻止了PAI-1对uPA的抑制作用。本研究为<中文标题>=以PAI-1为靶标的抗血栓性疾病及抗肿瘤药物的发现和设计提供了新的思路和结构基础。此外，embelin及其结构类似物可作为抗血栓性疾病和抗肿瘤的先导化合物进行深入的研究。