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苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV) ac53基因是杆状病毒基因组中的一个高度保守但功能未知的基因。本文对该基因的转录、表达以及亚细胞定位进行了系统的研究；同时利用ET—同源重组系统和Bac—to—Bac系统，构建了ac53缺失型重组病毒，研究了ac53在病毒复制中所起的重要作用；在ac53缺失的基础上，利用定点突变技术，相继构建出6株ac53点突变补回型重组病毒，对Ac53的功能进行了深入的研究。
ac53基因位于AcMNPV基因组44，712 nt～45，131 nt之间，全长420 bp，编码140个氨基酸，预计编码蛋白的分子量为16.994 kDa。在ac53起始密码子ATG的上游存在三个典型的杆状病毒晚期启动子元件TAAG。序列分析表明，Ac53的氨基酸序列在杆状病毒中具有高度的保守性，与PlxyMNPV、RoMNPV、BmNPV、MvMNPV的同源蛋白的相似性超过了90％。氨基酸序列的同源比对分析结果显示，Ac53中存在一个潜在的锌指环蛋白模序。
5—RACE结果表明ac53有两个转录起始位点，分别位于其ATG上游-15 nt～-12 nt和—45 nt～—42 nt的杆状病毒典型晚期启动子模序TAAG中的第二个碱基A。PCR扩增得到ac53全长读码框序列，将其克隆到原核表达载体pQE30上，在大肠杆菌中表达出分子量约为17 kDa的融合了六个组氨酸的His—Ac53融合蛋白。以纯化的His—Ac53融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了Ac53抗血清。免疫印迹分析表明，该抗血清能与感染AcMNPV的细胞总蛋白样品发生特异性反应。可检测到大小约为20 kDa的Ac53蛋白(比预期的16.994 kDa分子量大，推测可能是由于该蛋白发生了某些翻译后修饰所致)，且能在感染后(post—infection，p.i.)24 h被检测出来，并一直持续到72 h p.i.。这些结果均表明ac53可能是一个晚期基因。
为了研究Ac53在宿主细胞中的定位情况，我们构建了在ac53启动子控制下表达Ac53GFP(Green Fluorescence Protein，GFP)融合蛋白的重组病毒vAcac53GFP。通过激光共聚焦显微镜检测vAcac53GFP感染的Sf9细胞中绿色荧光的分布情况，追踪Ac53在宿主细胞中的位置变化。研究结果表明，在12 h p.i.，融合蛋白出现于细胞质中；24 h p.i.时，融合蛋白分布在整个细胞中；48 h p.i.到72 h p.i.，融合蛋白最终定位于紧靠核外膜的细胞质区域。该结果表明Ac53可能在感染的不同时期分别在核内核外行使功能。
为了进一步研究ac53在病毒侵染过程中的生物学功能，利用ET—同源重组技术将ac53从AcMNPV Bacmid中成功敲除，构建出ac53缺失型重组病毒。同时，利用Bac—to—Bac转座系统把αc53基因补回至ac53缺失型重组病毒的多角体蛋白基因(polh)位点，构建出ac53补回型重组病毒。将转座后均带有绿色荧光蛋白基因(gfp)和polh双标记的三种重组病毒：野生型病毒、ac53缺失型重组病毒和ac53补回型重组病毒分别转染Sf9细胞，发现ac53缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子；而ac53补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型基本一致。实时荧光定量PCR的实验结果证明，ac53的缺失并没有影响病毒DNA的复制。通过对病毒侵染细胞的超薄切片的透射电镜观察，发现ac53补回型病毒的表型与野生型病毒完全一致：而在ac53缺失型重组病毒感染的细胞中既有一些正常的核衣壳，又有大量类似核衣壳的空管子。以衣壳蛋白VP39的抗体为一抗进行了免疫电镜分析，证实了这些空管子是空的核衣壳，表明缺失ac53影响了核衣壳的装配效率。以上实验结果证明ac53是杆状病毒生活周期的一个必需基因，在核衣壳的装配过程中具有重要的作用。
利用定点突变技术对Ac53的类锌指环蛋白模序中的5个保守氨基酸位点(Cys29，Cys32，His58，Cys61，Cys92)分别进行了点突变，并将点突变的ac53与gfp融合，置于在ac53的启动子下，构建了6株重组病毒：vAcac53(M58)GFP、Acac53(M61)GFP、Acac53(M92)GFP、vAcac53(M2932)GFP、vAcac53(M293261)GFP和vAcac53(M293292)GFP。将这6种重组病毒感染细胞后，激光共聚焦观察发现：只有Ac53(M92)GFP融合蛋白的定位情况与野生型Ac53GFP一致；其余5种融合蛋白在感染后的所有时相中都没有入核，由始至终都定位于细胞质的核外膜区域。这个实验结果表明，Ac53的锌指环蛋白模序对于Ac53的入核是必需的。
把以上6种点突变的ac53基因补回至ac53缺失型重组病毒的polh位点，构建出6株点突变补回型重组病毒：vAcac53KO—M58REP—PH—GFP、Acac53KO—M61REP—PH—GFP、Acac53KO—M92REP—PH—GFP、vAcac53KO—M2932REP—PH—GFP、vAcac53KO—M293261REP—PH—GFP和vAcac53KO—M293292REP—PH—GFP。荧光显微镜观察结果、光学显微镜观察结果和病毒空斑实验表明，Acac53KO—M92REP—PH—GFP、vAcac53KO—M2932REP—PH—GFP和vAcac53KO—M293292REP—PH—GFP能形成可感染性病毒粒子，而其余3种点突变补回型重组病毒并不能进行病毒的增殖。这些实验结果说明Ac53的锌指环蛋白模序对于病毒粒子的增殖是必需的。
将以上6株点突变补回型重组病毒侵染细胞后制备超薄切片进行透射电镜观察，发现只有Acac53KO—M92REP—PH—GFP的电镜观察结果与野生型病毒一致，而其余5种点突变补回型重组病毒在它们侵染的细胞中都可以产生正常的核衣壳和大量类似核衣壳的空管子；并且在重组病毒vAcac53KO—M58REP—PH—GFP、Acac53KO—M61REP—PH—GFP和vAcac53KO—M293261REP—PH—GFP侵染细胞中产生的多角体没有包埋任何病毒粒子。以上实验结果表明Ac53的锌指环蛋白模序对于核衣壳的正常装配效率和病毒的成熟都是必需的。