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家蚕是一种模式昆虫，作为鳞翅目昆虫的典型代表，既具有经济价值，也是科研人员关注的焦点。其经济价值的主要体现为丝产业，而科研价值也主要集中于利用丝腺作为生物反应器生产外源蛋白，因此，对于家蚕丝蛋白合成分泌的研究就显得尤为重要。当前，随着家蚕基因组计划的顺利完成以及质谱等技术的不断革新，家蚕领域的研究已经进入组学时代。本次研究就借助了二代测序技术和质谱技术，分别在转录组和蛋白质组的层面，以1对自行构建的茧丝性质显著差异的近等位基因系家蚕(正常结茧品种IC和裸蛹品种IN)的后部丝腺为材料，探讨了丝蛋白合成的表达调控分子机理;本研究还检验了基因编辑技术CRISPR/Cas9对家蚕基因的变异特征，获得如下的研究结果: 1.近等位基因系家蚕的构建 为了更好地研究家蚕丝蛋白合成分泌的分子机理，本次研究以两个家蚕品种Nd和Ps为试验材料，利用多次回交的方法，将裸蛹品种中的Nd基因导入到Ps品种中，最终构建了除Nd基因以外，其他遗传背景基本一致的一对近等位基因系IC和IN。对比这一对近等位基因系的表型差异，结果表明，两个品种的前部丝腺和中部丝腺并无明显长度上的差别，但IN品种的后部丝腺则显著短于IC品种。此外，在化蛹期间，IC品种的个体表现为吐丝结茧，但IN品种不结茧而直接蛹化，因此，二者在丝产量方面存在显著性差异。 2.差异表达的mRNA对丝蛋白合成分泌的调控机制 以家蚕IC和IN的5龄第3天的后部丝腺为试验材料，利用RNA-seq技术进行测序分析，结果发现，在IN品种中，编码丝蛋白三种成分以及一些丝胶蛋白的基因表达水平下调，这使得丝的产量显著降低;编码核糖体蛋白的基因表达量下降，降低了核糖体的功能，减弱了核糖体的生物学活性;与生长发育相关的基因表达量减少，导致了丝腺细胞发育受到阻碍，从而不能维持正常的形态来确保蛋白质的合成;能量代谢降低的同时，裸蛹个体中的细胞迅速死亡，表明能量代谢减弱且大部分作用于细胞自身发育，从而导致丝蛋白合成代谢过程中能量供应不足。此外，编码丝素酶的基因显著上调，也导致了丝素蛋白被大量降解，丝蛋白的产量随之降低。 3.差异表达的miRNA对丝蛋白合成分泌的调控机制 miRNAs是存在于动植物体内的一类内源性单链小分子RNA，对生物个体的转录后基因表达调控起到关键的作用。利用RNA-seq的技术，我们系统性地比较了两个品种的miRNA表达谱，发现在IN中miRNAs数量要明显多于IC品种，进一步对miRNAs进行功能分析发现，影响丝蛋白合成分泌的miRNAs主要作用于以下几个方面:参与调控丝蛋白的主要成分以及调节丝蛋白表达的转录因子，抑制编码丝蛋白基因的表达;参与细胞周期调控，影响丝腺细胞的发育，导致丝蛋白合成分泌的场所发育不健全;参与能量代谢调控，裸蛹体内的能量合成降低，且更多的能量作用于个体的发育而不是蛋白质的合成。 4.蛋白质的差异磷酸化水平对丝蛋白合成分泌的调控机制 利用质谱分析的蛋白质组学技术，分析了两个品种后部丝腺的磷酸化蛋白质组学数据，获得了家蚕的蛋白质磷酸化特征，即家蚕的肽段或者蛋白均主要发生单一磷酸化事件，且磷酸化事件主要由acidic和proline-directed两类激酶进行催化，同时，丝氨酸为家蚕中最多被磷酸化的位点，其次为苏氨酸和酪氨酸。磷酸化修饰对于丝蛋白合成分泌的调控主要包括:下调翻译相关蛋白质的磷酸化水平，影响蛋白的产量;下调转运与分泌过程相关的蛋白质磷酸化，导致胞内蛋白积累，影响新蛋白的合成和功能的行使;增加能量代谢，但由于个体生长发育迅速，作用于蛋白质合成的能量消耗减少;下调丝素重链蛋白的磷酸化，阻碍了丝蛋白空间结构的形成并抑制了丝蛋白分泌到丝腺腔这一生物学过程。 5.CRISPR/Cas9技术引导的家蚕基因变异特征 CRISPR/Cas9技术可以在家蚕中介导高效率的基因突变，且突变特异性较好，合理选择靶位点后，不容易产生脱靶现象。对突变后的个体进一步分析发现如下结果:G0代中的一些突变可能发生于体细胞中，从而造成该部分变异不能遗传给后代;基因型变化并不等同于表型变化，在突变的个体中，有可能会发生无义突变的现象，使得表型改变率低于基因变异率。这些结果提示对于突变效率的统计，需要同时检测G0代和G1代，同时，对于一些具有表型变化的基因，既根据表型改变进行筛选，也应结合测序技术检测对应的基因型，以免造成突变个体的遗失。此外，为了获得突变体，合适的靶点、未污染的mRNA、恰当的注射时间等都是比较关键的方面。 综上所述，本研究首先构建了结茧(IC)和裸蛹(IN)的1对近等位基因系家蚕，以这2个品种为研究对象，从mRNA、miRNA、磷酸化蛋白质三个方面对比了基因以及蛋白表达谱的差异，探讨了丝蛋白合成分泌的调控机制，同时，利用CRISPR/Cas9技术，对家蚕的基因组进行编辑，获得了相关的结果，为进一步研究关键基因对丝产量的影响以及高效的利用丝腺作为生物反应器来生产外源蛋白奠定了基础。