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从云南元江瓦纳高温热泉采集的7份水样经过选择培养基初筛,得到7株可以在70℃条件下生长并产生淀粉酶的菌株。对这7株高温菌进行复筛,得到淀粉酶活较高的产酶菌株D19(65.8U/mL)和D20(56.1U/mL)。通过形态特征观察表明菌株D19和D20都是芽孢杆菌,且都是嗜热芽孢杆菌。在此基础上将菌株D19和D20和其他嗜热芽孢杆菌进行生理生化特征的对比,结果表明菌株D19与G.thermoleDvorans、G.thermodenitrificans和G.uralicus的生理生化特征比较相似,只有3项生理生化特征的差异;而菌株D20与G.uzenensis和G.uralicus的生理生化特征很相似,只有2项生理生化特征的差异。进一步对2株菌进行16SrRNA基因序列分析,结果表明,菌株D19与G.kaustophius、G.zalihae、G.vulcani、G.thermoleovorans的序列相似性都为100%,具体分类地位有待于做进一步的研究;而菌株D20与G.uralicus的序列相似性最高,为99.7%,再根据生理生化等方面的综合鉴定,菌株D20鉴定为G.uralicus的菌株。
在初始发酵条件下,菌株D19所产淀粉酶的酶活力为65.8U/mL,菌株D20所产淀粉酶的酶活为56.1U/mL。通过对影响酶活力的培养温度、摇床转速、发酵时间以及培养基中的碳源、氮源、无机盐和起始pH等条件进行单因素实验,并对碳源、氮源和无机盐三因素进行正交试验,菌株D19的优化产酶条件是:以2.5%的玉米粉,1.0%的黄豆粉,0.3%硫酸镁为培养基,起始pH调为6.0,培养温度55℃,200r/min摇床培养48h,优化后的酶活为85.2U/mL,比原始发酵条件下的酶活提高29.5%;菌株D20的优化产酶条件是:以2.5%的玉米粉,2.0%的黄豆粉,0.7%硫酸镁为培养基,起始pH调为6.0,培养温度60℃,150r/min摇床培养48h,优化后的酶活为74.3U/mL,比原始发酵条件下的酶活提高32.4%。
对2株菌产生的淀粉酶进行酶学性质初步研究表明,在以淀粉为底物时,菌株D19所产淀粉酶的最适反应温度为85℃,耐热性较差,在70℃处理十分钟后酶活降低至30%左右;最适反应pH为6.0,耐酸性较好,在pH3~6之间较为稳定,在pH3处理一小时后仍保留80%的酶活性;酶的耐热性能对钙离子存在依赖性,当加入钙离子浓度为0.04mol/L时,酶的耐热性提高60%;通过添加酒精测定耐酒精性能,当添加酒精浓度为30%时,残存酶活性为30%左右。菌株D20所产淀粉酶的最适反应温度为90℃,耐热性较强,在70℃和80℃处理1h后酶活仍保留了50%以上:最适反应pH为5,在pH中性较为稳定,在pH5~7处理一小时后仍保留80%以上的酶活性;酶的耐热性能对钙离子存在依赖性,当加入钙离子浓度为0.02mol/L时,酶活性提高80%;通过添加酒精测定耐酒精性能,当添加酒精浓度为30%时,残存酶活性为20%左右。