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肺癌发病率高、死亡率高,肺癌患者的五年生存率不到10％,单一治疗手段很难收到显著成效,故倡导肿瘤的多学科综合治疗。且近年来生物治疗在肿瘤治疗中扮演了愈来愈重要的角色。
近年来生物治疗在肿瘤治疗中扮演了愈来愈重要的角色。目前的临床上应用的生物治疗手段主要是生物工程药物如干扰素、白介素-2、生长激素、EPO、TPA、GM-CSF等的使用,但此类药物价格昂贵。
干扰素家族是最早发现的细胞因子之一,其包括Ⅰ型IFN(IFN-α、IFN-β、IFN-κ(等)和Ⅱ型IFN(IFN-γ),近年来发现了Ⅲ型IFN(IFN-λ家族)。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素在诸多研究中均具有抗肿瘤作用,IFN-α作为最早投入临床使用的生物工程药品已用于多种肿瘤的临床治疗。本实验研究IFN-λs抗肺癌作用的价值。
IFN-λs包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ33个成员(又称IL-29、IL-28A和IL-28B)。人IL-29与IL-28A的氨基酸同源性为81％,而人IL-28A与IL-28B的氨基酸同源性则为96％；小鼠只有INF-λ2(IL-28A)和INF-λ3(IL-28B)基因,小鼠的INF-λ2和INF-λ3氨基酸同源性为高达98％。
IFN-λs抗肿瘤作用可能途径为:1.抑制肿瘤病毒的复制2.诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖3.调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞4.作用于肿瘤的基质细胞及抗肿瘤血管形成。
国外学者在T淋巴细胞瘤BW5147、神经内分泌肿瘤BON1等细胞的体外细胞研究中发现IFN-λs具有明显抑制肿瘤细胞生长作用,而在小鼠黑色素瘤及小鼠纤维肉瘤等的体内研究中发现IFN-λs具有抑制肿瘤生长及肿瘤转移的作用。国内对IL-28和IL-29的研究刚刚起步,对IFN-λs的研究主要研究基因重组技术体外抗人肝炎病毒活性,有学者进行人重组IL-28/IL-29质粒的构建及转染的研究,但在其抗肿瘤作用方面尚无相关报道。本课题选用鼠INF-λ2(IL-28A)及人IFN-λ1(IL-29)进行相关研究,并致力于探索鼠INF-λ2重组腺病毒载体对肺癌的影响方面进行体内外研究。
本研究的目的在于:
1.构建出高滴度的重组mIFN-λ2腺病毒载体及重组hIFN-λ1腺病毒载体,并建立稳定表达鼠λ2-干扰素的CHO细胞系,为进行体内外抗肿瘤研究奠定坚实基础。
2.通过重组mIFN-λ2腺病毒感染LA795细胞体外培养的研究,并通过细胞凋亡、PCR等检测,探讨mIFN-λ2对肿瘤细胞LA795的生长影响及其机制。
3.通过重组mIFN-λ2腺病毒对LA795荷痛鼠的体内转染后影响的研究,测定一些免疫指标(NK、CD8+等),进一步探讨IFN-λs对肺癌的治疗机制。
研究方法如下:
1.mIFN-λ2及hIFN-λ1基因克隆表达载体的构建及抗病毒活性鉴定。
2.重组mIFN-λ2及hIFN-λ1腺病毒载体构建及腺病毒包装①mIFN-λ2及hIFN-λ1基因业克隆入腺病毒穿梭载体,pShuttle-CMV-mIFN-λ2及pShuttle-CMV-hIFN-λ1的构建。
②同源重组腺病毒质粒的构建即Ad-pshuttle-cmv-hIFN-λ1及Ad-pshuttle-cmv-mIFN-λ2的构建。
③重组腺病毒载体的包装和扩增。
3.重组mIFN-λ2及hIFN-λ1腺病毒鉴定及病毒滴度测定①基因组试剂盒提取重组mIFN-λ2及hIFN-λ1腺病毒的DNA基因组,PCR鉴定mIFN-λ2及hIFN-λ1是否导入包装的腺病毒中。
②Western blot鉴定重组mIFN-λ2腺病毒感染细胞后mIFN-λ2蛋白的表达。
③XCID50法对构建的腺病毒滴度进行测定。
4.重组mIFN-λ2腺病毒作用小鼠肺腺癌(LA795)的体外研究①重组mIFN-λ2腺病毒感染小鼠肺腺癌(LA795)细胞,MTT泫测定细胞增殖情况。
②重组mIFN-λ2腺病毒感染小鼠肺腺癌(LA795)细胞,Tunnel测LA795的细胞凋亡情况。
③重组mIFN-λ2腺病毒感染小鼠肺腺癌(LA795)细胞,Real-time PCR测mIFN-λ2的mRNA的基因表达。
5.体内的作用机制研究①昆明鼠LA795肿瘤模型的制备病理检查后证实鼠LA795肿瘤模型的成功建立。
②重组mIFN-λ2腺病毒载体对致瘤小鼠的干预。
③肿瘤在动物体内生长情况的指标测定④流式细胞仪对免疫指标(NK、CD4+、CD8+细胞)测定⑤上述动物肿瘤组织用Tunnel测定肿瘤细胞的凋亡情况。
⑥PCR检测:PCR检测肿瘤组织的mIFN-λ2mRNA水平。
6.统计学处理采用SAS6.12版进行统计学处理。
研究结果如下:
1.hIFN-λ1基因克隆、真核表达载体的构建及抗病毒活性测定1.1 hIFN-λ1基因克隆和PCR产物分析经VSV病毒诱导的人HeLa细胞mRNA用RT-PCR扩增。其产物行琼脂糖凝胶电泳,出现大小约为610bp,与所需克隆的hIFN-λ1基因大小相一致。
1.2 PMD18-T-hIFN-λ1 Vector的酶切鉴定和测序将克隆的hIFN-λ1目的基因与Vector测序载体重组连接,转化至感受态大肠杆菌,阳性克隆扩增,提取质粒PMD18-T-hIFN-λ1 Vector酶切鉴定,出现610 bp大小的带,测序与GenBank上报道的序列完全一致。
1.3 PCAGG-hIFN-λ1真核表达载体的构建及筛选鉴定将PMD18-T-hIFN-λ1 Vector质粒酶切处理得到目的片段,PCAGG载体酶切处理,将酶切下片段与处理的载体重组连接并转化至感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆扩增酶切鉴定,出现610 bp大小的带。
1.4 hIFN-λ1抗病毒活性测定用VSV*GFP-A549细胞系测定PCAGG-hIFN-λ1转染上清的抗病毒活性,结果显示:未加病毒的阴性对照组没有荧光,PCAGG空载体转染BHK-21细胞的上清处理的细胞孔和BHK-21常规培养细胞的上清处理的细胞孔出现大量荧光,VSV*GFP-A549在A549细胞上大量复制；PCAGG-hIFN-λ1101～104倍稀释时能抑制病毒复制,105倍稀释时病毒复制与对照组无差异,104倍稀释孔荧光亮度约为对照组的一半,PCAGG-hIFN-λ1活性104IU/mL。
2.mIFN-λ2基因克隆及鉴定2.1 mIFN-λ2基因克隆和PCR产物分析VSV病毒诱导鼠脾脏细胞mRNA的RT-PCR扩增产物,经琼脂糖凝胶电泳后出现大小约为582 bp的条带,大小与所需克隆的mIFN-λ2基因大小相一致。
2.2 PMD18-T-mIFN-λ2的酶切鉴定和测序克隆的mIFN-λ2目的基因与PMD18-T Vector测序载体重组连接,转化至感受态大肠杆菌,阳性克隆扩增,提取质粒酶切处理酶切出现约582 bp的带,测序结果与GenBank上报道的完全一致。
3.hIFN-λ1基因及mIFN-λ2基因亚克隆入腺病毒穿梭载体及同源重组腺病毒质粒酶切分别将PMD18-T-hIFN-λ2及PMD18-T-mIFN-λ2和pShuttle-CMV,将hIFN-λ1及mIFN-λ2片段插入到pShuttle-CMV上,转化细菌,挑选克隆进行酶切鉴定,分别出现610 bp及582 bp大小的带。将pShuttle-CMV-hIFN-λ1及pShuttle-CMV-mIFN-λ2载体线性化后电穿孔转化含有pAd-Easy骨架载体BJ5183感受态细菌,取质粒并PacⅠ酶切鉴定,分别出现20×103bp和4.5×103bp大小的带,表明重组腺病毒质粒pAd-mIFN-λ2构建成功。重组腺病毒pAd-mIFN-λ2及pAd-hIFN-λ1质粒采用PCR扩增鉴定,分别出现约582 bp和610 bp的带。
4.TCID50法对构建的腺病毒滴度进行测定Ad-mIL-28病毒滴度为:3×108pfu/ml；pAd-hIL-29的病毒滴度为:4×107pfu/ml。
5.免疫荧光检测mIL-28蛋白的表达LA795细胞分别感染重组腺病毒Ad-mlFN-λ2、Ad-LacZ,与对照组相比,结果显示PBS组、Ad-LacZ组在任何时段都未见红色荧光,Ad-mIFN-λ2组在12h、24h也未见红色荧光表达,36h、48h、72h时均可见红色荧光,且随时间有表达增多趋势。
由此得出以下结论:
1.成功地构建了PCAGG-hIFN-λ1及PCAGG-hIFN-λ2,并能高效地转染至BHK-21细胞等,且具有较强的抗病毒活性。
2.成功地构建了PCAGG-EGFP-mIFN-λ2并能高效稳定地转染至CHO细胞等,且具有较强的抗病毒活性,且与诱导Mx1抗病毒蛋白密切相关。
3.成功地构建了Ad-hIFN-λ1及Ad-mIFN-λ2并高效地转染至LA795细胞、293A细胞等。
4.体外试验Ad-mIFN-λ2转染对肿瘤细胞的生长有抑制作用；Ad-mIFN-λ2转染组细胞凋亡较对照组明显增加。
5.体内试验表明Ad-mIFN-λ2对肺癌的生长有抑制作用,且可能通过NK细胞促进肿瘤细胞的凋亡而起作用。