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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,居我国恶性肿瘤死亡率的第二位。迄今为止,外科手术治疗仍是目前肝癌治疗的首选方法,但手术切除存在的突出问题是切除率低,复发率高;据统计,肝癌根治性切除术后5年复发率高达80%,小肝癌术后复发率也达40%～60%。由于肝癌手术切除率低于15%,介入化疗也只有10%的有效率,因此,发展肝癌新的治疗手段和药物对于保障我国人民健康具有十分重要的意义。由我室自主研发的抗癌药物Licartin是全球首个用于治疗肝癌的单抗类药物,用放射性核素碘[131I]标记美妥昔单抗（单抗HAb18的F（ab’）2段,靶点为肝癌相关膜分子HAb18G/CD147）而得,该药可显著抑制HCC临床进展、抑制晚期HCC患者肝移植术后的肿瘤复发转移率,并显著延长患者生存期,已被证明是治疗HCC的安全有效的药物。但是该药目前仍存在生产成本高,临床使用中少数病例出现了HAMA反应即潜在的免疫原性,同时由于缺少抗体的Fc,因此也没有天然抗体所能介导的生物学功能。因此,我们有必要在其基础上研发新一代的抗体类药物。本研究将以单抗HAb18为基础,首先对该单抗的可变区进行人源化改造,获得新的抗体片段HAb18-huScFv,之后与人IgG1 Fc融合表达得到双价的人源化抗体片段（HAb18-huScFv）2-Fc,最后在体外验证该抗体片段的抗肿瘤活性,以期获得具有较好抗肿瘤活性的二代工程抗体分子。下面将从两部分分别进行阐述。第一部分: （HAb18-huScFv）2-Fc的构建和表达目的:获得（HAb18-huScFv）2-Fc蛋白方法:首先通过对鼠源性肝癌单抗HAb18的抗体可变区序列分析,并同Genbank的nr库做BlastP,其中抗体序列来源分别选择Homo sapiens和Mus musculus两类。对相似性得分最高的人源、鼠源抗体可变区序列各100条进行统计,获得单抗HAb18的差异残基和异常残基;之后通过模建抗体可变区的精确三维模型,获得HAb18 VH、VL的分子内和分子间氢键相互作用,以及相对表面可及性,综合考虑残基的相对保守性,最终确定进行人源化改造的候选突变位点。以HAb18-ScFv基因为模板,用点突变PCR的方法获得其人源化形式HAb18-huScFv的序列,克隆至表达载体获得pCDNA5/FRT-（HAb18-huScFv）2-Fc,将表达载体用脂质体转染到真核细胞Flp-in CHO中,加压、筛选以获得稳定表达株。进行常规细胞培养并收集上清,用HiTrap MabSelect SuRe和HiTrap chelating HP column对稳定表达株的培养上清进行连续纯化,采用间接ELISA, SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测。同步构建其鼠源形式（HAb18-ScFv）2-Fc以作为平行对照,所有相关实验与（HAb18-huScFv）2-Fc相同。结果:按照Kabat、Abm、Chothia和Contact的规则标出了肝癌单抗HAb18 CDR,FR;经过筛选的抗体序列经过分析,获得了已有抗体分子不同位点上氨基酸种类和百分比,将该结果和单抗HAb18的可变区氨基酸比对后,获得了该序列的差异残基和异常残基;结合三维重建模型,获得了HAb18 VH、VL分子内和分子间氢键相互作用和氨基酸表面可及性,确定人源化方法为残基H19K, H90A和L10F分别突变为H19A, H90T, L10S。重叠PCR合成突变的基因后,测序验证基因序列正确,将突变后的基因克隆至表达载体,再次测序验证正确。转染真核细胞进行表达,加压筛选并克隆化,获得稳定表达的细胞株。色谱柱纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:在非还原状态下,目标蛋白的分子量约为110kDa;还原后为一条带,分子量约为55kDa。其鼠源形式片段的分子量与之一致。因此,以上数据表明已经成功表达并制备了（HAb18-huScFv）2-Fc蛋白。第二部分:（HAb18-huScFv）2-Fc的生物学特性鉴定目的:验证（HAb18-huScFv）2-Fc的抗原结合活性,体外抗肿瘤活性和免疫原性。方法:间接竞争ELISA分析与HAb18G/CD147的结合活性,用不同浓度的（HAb18-huScFv）2-Fc与亲本抗体HAb18竞争结合包被的HAb18G/CD147,分析结合的亲和力和特异性;用表面等离子共振技术分别检测（HAb18-huScFv）2-Fc和（HAb18-ScFv）2-Fc的结合常数（Kon）和解离常数Koff,并计算其亲和力常数（KD）;用细胞免疫荧光及免疫组化法在不同水平上分析并比较（HAb18-huScFv）2-Fc和（HAb18-ScFv）2-Fc与肝癌细胞FHCC-98和HCC组织的结合特性。在明胶酶谱试验中,用两种抗体分别处理共培养的人肺成纤维细胞（HPF-1）和人肝癌细胞（FHCC-98）,并与空白对照组进行比较。在侵袭试验中,将FHCC-98细胞与人肺成纤维细胞等比例混合加入小室,用两种抗体处理后观察其侵袭活性的变化。ADCC和CDC试验分别观察在（HAb18-huScFv）2-Fc的介导下,PBMC和兔血清对肝癌细胞FHCC-98的细胞毒效应。检测抗体的免疫原性时,将抗HAb18抗体阳性病人的血清先经过与HAb18识别CD147不同表位的单抗5A5的预吸附（pre-absorption）,以除去其中的游离CD147,抗同种型抗体和抗同种异性抗体,再将不同浓度的（HAb18-huScFv）2-Fc和（HAb18-ScFv）2-Fc分别与HAb18-F（ab’）2混合,去竞争结合处理后的血清中的抗独特型抗体,用间接竞争ELISA法测得两种抗体对每份血清的的50%抑制浓度（IC50）,通过研究它们对HAb18-F（ab’）2与患者血清中抗独特型抗体的结合的抑制能力的差异,分析其免疫原性的差异。结果:（HAb18-huScFv）2-Fc可以与HAb18竞争结合分子HAb18G/CD147的同一表位, （HAb18-huScFv）2-Fc和（HAb18-ScFv）2-Fc对肝癌细胞和肝癌组织的结合能力及特点相差不大(前者亲和力常数（KD）为1.5×10-9M,后者为1.2×10-9M)。与对照组相比,两种抗体片段均可以抑制肝癌细胞FHCC-98分泌基质金属蛋白酶并抑制肿瘤细胞的侵袭活性（p<0.05）,且在两种抗体之间没有明显差异。（HAb18-huScFv）2-Fc对靶细胞具有细胞毒效应（p<0.05）,且呈剂量依赖关系。抗体片段的免疫原性有明显的降低,在四份试验血清中,两种抗体的IC50值差异均有显著性,其P值分别为p=0.0440,p<0.0001,p=0.0338,p<0.0001。结论:经过改造优化的人源化抗体片段（HAb18-huScFv）2-Fc在降低了抗体免疫原性的同时,保留了抗原结合活性,并且具有细胞毒效应和肿瘤抑制活性,是一种很有应用前景的抗体形式。