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目的:钙连蛋白(Calnexin，Canx)是内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白和重要的内凝集素分子伴侣，监控真核细胞蛋白折叠和装配，调节内质网Ca2+稳态和Ca2+介导的信号转导过程，参与多种重要生物学功能。本课题组前期研究发现，日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)Canx(SjCanx)基因在不同宿主因子影响下的肺期童虫中具有显著的差异表达。本文初步研究该基因对日本血吸虫童虫生长发育的影响;同时克隆、表达其蛋白后，观察重组蛋白的免疫保护作用，为探寻新的疫苗与药物作用靶点提供基础资料。 方法:利用在线工具对SjCanx氨基酸序列进行生物信息学分析，使用Clustal X2软件对血吸虫Canx及其它物种Canx氨基酸序列进行比对，利用Swiss Model在线工具绘制SjCanx三维模式图，使用Mega5.5sofeware构建SjCanx和其它物种同源物系统进化树。收集日本血吸虫不同发育期的虫体，提取RNA并逆转录为cDNA，用Real-Time PCR法鉴定SjCanx基因在日本血吸虫不同发育时期虫体中的mRNA表达。设计并合成SjCanx基因的小干扰RNA(siRNA)，在日本血吸虫尾蚴经机械断尾转化成童虫后将其与童虫共培养，收集培养6d的日本血吸虫童虫，一部分置于光镜下观察、拍照，并使用IPP6.0软件对童虫进行形态学统计分析;另一部分利用real-time PCR检测目的基因的沉默效果。提取日本血吸虫成虫的总RNA，逆转录获得cDNA，根据SjCanx对应的胞外段基因序列设计并合成特异性引物，以cDNA为模板扩增，目的基因与pET28a(+)质粒进行双酶切、连接和转化，挑取阳性克隆，PCR法检测后测序鉴定;提取测序正确的质粒DNA，将其转化入原核表达宿主菌BL21;挑取阳性克隆，用IPTG诱导目的蛋白表达，SDS-PAGE、western blot检测表达结果，免疫磁珠法纯化重组蛋白(rSjCanx)。用纯化获得的rSjCanx免疫新西兰家兔，获取多克隆抗血清，免疫组织化学法定位目的基因在童虫中的分布。将rSjCanx免疫BALB/c小鼠3次，末次免疫2周后感染日本血吸虫尾蚴30±1条，42天后解剖小鼠，灌注法冲虫收集日本血吸虫成虫，摘取0.5g左叶肝脏组织匀浆、消化后收集虫卵，显微镜下计数，计算减虫率和减卵率;取黄豆大小右叶肝脏组织固定、HE染色，测量单个虫卵形成的肉芽肿面积，计算面积减小率（与对照组比较）;同时眼底静脉采血，收集血清，ELISA夹心法测定Th1型和Th2型细胞因子IL-4和IFN-γ的含量。 结果:生物信息学分析显示，SjCanx的分子式为C2949H4528N782O907S18，为稳定性亲水跨膜蛋白，与SmCanx的同源性较高，相似率达84％。Real-time PCR法检测SjCanx基因在不同发育时期虫体中的表达，结果发现其mRNA在感染3d的肺期童虫中表达水平最高、虫卵中最低。siRNA作用后，培养6d的干扰组童虫其体长、体宽、面积及体积分别为145.79±26.08μm、53.25±9.56μm、(2.88±0.67)×104μm2、（20.88±7.42）×104μm3，均显著小于对照组的159.36±35.74μm、56.33±9.45μm、(3.30±0.73)×104μm2、(25.62±9.27)×104μm3(P＜0.05);Real-time PCR结果显示，SjCanx基因的沉默效率为55.4％(P＜0.05)。根据SjCanx胞外段对应基因序列，设计的上游引物为CGGGATCCAATCCTGAGTTAGAACCTGAAG、下游引物为CCGCTCGAGTTTCTCATTGTAAGTTTCCCG，构建了重组表达质粒pET28a(+)-SjCanx，获得的rSjCanx经western-blotting检测发现其大小与理论分子量一致，约为53.5kDa。rSjCanx免疫家兔，获取的抗血清经ELISA法测定其滴度达1∶12800。免疫组化结果显示，SjCanx基因主要定位于童虫的实质和表膜。免疫保护结果发现，rSjCanx免疫组诱导的减虫率10.36％(P＞0.05)、减卵率为30％(P＜0.05)，单个虫卵导致的肝肉芽肿面积为(0.157±0.036)×105um2，比佐剂组的肉芽肿面积减小23％(P＜0.05)。ELISA法检测各组血清的细胞因子结果显示，IFN-γ和IL-4在空白对照组、佐剂组与rSjCanx免疫组分别为19.75±5.38pg/ml和7.56±1.92pg/ml、22.05±5.05pg/ml和7.60±2.53pg/ml，37.33±8.07pg/ml和7.65±2.18pg/ml;统计学分析发现，免疫组小鼠血清IFN-γ显著高于佐剂组(P＜0.05)，但IL-4无显著差异(P＞0.05)。 结论:SjCanx基因沉默后影响了童虫的生长发育，提示Sanx在童虫生长发育过程中具有重要作用;克隆表达了SjCanx胞外段对应基因的rSjCanx;rSjCanx可产生30％的减卵率，其机制可能是通过增强Th1型细胞因子IFN-γ免疫应答来实现。