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钙离子是最为重要最为普遍的胞内信使。钙离子在基因表达、胰岛素分泌和心肌兴奋收缩偶联中起重要作用。钙离子以其时空特异性的形式调节了这些活动。细胞核内钙信号调控了基因表达。研究细胞核内钙调控机制有助于认识钙离子是如何调控基因表达的。胞浆内钙信号是胰岛素分泌和心脏兴奋收缩所必需的。研究胞浆内的钙调控机制有助于认识钙离子是如何调控胰岛素分泌和心脏兴奋收缩的。本课题运用激光共聚焦显微镜、荧光测钙、Heochest染料、基因敲除小鼠、ELISA、Western blot、RT-PCR、Real time RT-PCR、动物实验、电子显微镜等技术系统研究了细胞核钙调控的机制、RyR2调节蛋白FKBP12.6在胰岛素分泌和心肌肥大中的作用机制。
本课题主要结果和结论如下：
1.利用激光共聚焦显微镜和Hoechest33342及Fluo-4区域化了细胞核内的钙信号。研究了胞外ATP、葡萄糖、KCl刺激下，细胞核和细胞浆内钙活动的动力学特点。发现：①集中在细胞核膜及其周围的IP3Rs介导了胞外ATP诱导的细胞核内钙瞬变；②在2mM钙外液情况下，25mMKC1去极化引起胰岛β细胞核和细胞浆基本一致的钙瞬变；③胰岛β细胞的细胞核内存在葡萄糖或ATP敏感的钙库。
2.功能性RyRs在胰岛中表达。RT-PCR结果显示RyR三种亚型均在胰岛中表达。荧光标记ryanodine结果显示RyRs不仅分布于胰岛β细胞内质网上，还在细胞核膜上表达。0.1mM ryanodine抑制了葡萄糖和KCl诱导的胰岛钙升高。这提示RyRs参与了胰岛的兴奋-分泌偶联。
3.FKBP12.6敲除促进胰岛素分泌并抵抗高脂饮食诱导的高血糖。相对于同窝生的野生型，FKBP12.6-/-小鼠正常喂养时血清中胰岛素水平显著升高，而血糖没有变化，饥饿时的胰岛素和血糖均与野生型没有差别，体重也没有差别，葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性均没有变化。体内和体外的实验均表明FKBP12.6敲除增强了葡萄糖刺激的胰岛素分泌，这可能是由于FKBP12.6敲除增强了葡萄糖刺激的胰岛钙升高。高脂饲料饮食3个月后，与对照组WT小鼠相比，FKBP12.6-/-小鼠呈现更高的体重、更高的血清胰岛素和更低的血糖。这说明FKBP12.6敲除促进胰岛素分泌并抵抗高脂饮食诱导的高血糖。
4.FKBP12.6基因敲除引起雄鼠年龄依赖的心肌肥大和心力衰竭。2.5个月龄的FKBP12.6-/-雄鼠呈现心肌肥大且射血分数增强，12个月龄的FKBP12.6-/-小鼠心肌不再肥大但射血分数显著下降。2.5个月龄的敲除鼠心脏形态正常，T管和RyR2的分布排列有规则，亚显微结构正常，12个月龄的敲除鼠心肌出现大范围坏死，亚显微结构异常。2.5个月龄的敲除鼠心电图正常，12个月龄的敲除鼠出现P波倒置、ST段抬高等心律失常。
5.Insulin/AKT信号通路参与了FKBP12.6敲除引起的雄鼠心肌肥大。2.5个月龄敲除雄鼠心肌肥大且射血分数升高，心肌细胞场刺激诱发的钙瞬变和肌质网钙容量正常。2.5个月龄的心脏AKT磷酸化水平显著升高，而神经磷酸酯酶(calcineuron)的活性没有变化。KO雄鼠血清胰岛素水平显著升高而KO雌鼠血清胰岛素水平没有变化。这说明年轻FKBP12.6-/-雄鼠心肌肥大是由insulin/AKT信号通路介导的，Ca2+/calcineurin信号通路没有参与其中。
6.calcineurin信号通路和长时间激活的AKT信号通路调控了老年FKBP12.6-/-雄鼠心力衰竭。12个月龄敲除雄鼠心力衰竭。Calcineruin的活性明显升高，AKT的磷酸化水平仍然明显明显高于野生型。