基于麦胚凝集素识别作用的O-GlcNAc的定量检测

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O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰。自1984年发现O-GlcNAc修饰以来,大量的研究证明O-GlcNAc修饰的水平与神经退行性疾病、糖尿病、癌症等疾病密切相关。然而O-GlcNAc修饰的糖苷键易于断裂,处于亚化学计量水平,具有动态性,蛋白质多为低丰度蛋白质,这为检测方法的建立带来不便,特别是定量检测。目前检测O-GlcNAc的方法存在灵敏度低;样品前期准备复杂;昂贵、数据处理难;需要标记和富集等问题。因此,迫切需要建立灵敏、简单、免标记和免富集的快速检测O-GlcNAc的方法,有助于糖尿病、癌症等威胁到人类健康的严重疾病的早期诊断。基于此,利用凝集素(WGA)与O-GlcNAc的特异性识别作用,建立了简单、灵敏、准确定量检测O-GlcNAc的方法。主要工作内容如下:  (1)用WGA修饰碳量子点(GQDs)标记的作为荧光探针,建立了简单、灵敏、快速检测O-GlcNAc的荧光方法。首先,采用简单的热解法合成GQDs,用FT-IR、UV-vis、TEM、荧光对其性质、形貌和结构进行了表征。接下来,对WGA修饰的GQDs体系进行优化。WGA修饰的GQDs用于O-GlcNAc的定量检测,由于WGA与O-GlcNAc的特异性识别作用使O-GlcNAc吸附在量子点表面,从而屏蔽了GQDs的荧光信号,荧光信号的改变值与吸附的O-GlcNAc的量成线性关系。基于此,用WGA/GQDs荧光探针定量检测了O-GlcNAc糖基化的标准多肽,最低检测限为8.2×10-16M,线性检测范围4.65×10-15-1.86×10-13M,线性相关系数为0.993。各种金属离子、单糖及氨基酸的干扰实验证明此方法具有良好的选择性。最后,此方法成功用于实际样品α-晶体蛋白和细胞内O-GlcNAc的检测。  (2)结合AuNPs和N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(OGA)研制了一种灵敏、准确定量检测O-GlcNAc的SPR生物传感方法。对WGA进行了AuNPs标记,使方法的最低检测限和检测范围均提高了十倍左右。为了避免末端为GlcNAc的其它糖和唾液酸干扰O-GlcNAc的准确测定,采用了O-GlcNAc的专一性剪切酶OGA,剪切后信号的下降与O-GlcNAc的浓度相关。根据酶切前后信号的变化△R与O-GlcNAc的浓度建立了工作曲线。方法的最低检测限为4.65×10-13M,线性范围为4.65×10-12-4.65×10-7M,线性相关系数为0.999。进一步用此方法检测了α-晶体蛋白中O-GlcNAc的含量,最低检测限比报道的方法低十倍左右。为了更好地验证方法能否用于复杂样品中O-GlcNAc含量的检测,将方法用于了细胞内O—GlcNAc的检测,结果表明三种癌细胞(MDA-MB-231,MDA-MB-468和SW480)中O-GlcNAc的含量明显高于正常细胞(HEK293),与报道的相符,也进一步证明此方法有望用于癌症的早期临床诊断。
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