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水稻是世界上最重要的粮食作物,全球大约有一半人口以稻米为主食。矮生性作为水稻重要农艺性状,引领了上世纪60年代的第一次“绿色革命”,使得水稻单产提高了20%以上。然而几十年来,真正能够在生产上利用并大面积推广的矮杆基因资源非常匮乏。同一矮源的大面积推广造成水稻品种遗传基础的单一化,这无疑对水稻单产的进一步提高是不利的。因此寻找、发掘和利用新的矮化资源,揭示其矮化的分子机理,对于从根本上突破矮化育种瓶颈,促进水稻单产的稳定提高具有非常重要的意义。
我们在水稻转基因后代中筛选获得一个显性矮杆突变体,命名为DD1。该突变体株高大约为野生型的一半,叶片宽而短,分蘖增多,结实正常,生育期与野生型相比略有推迟。组织学观察表明矮化是由于茎杆细胞缩短引起的;外源GA响应实验表明GA能有效回复矮化的表型;α-淀粉酶诱导实验显示突变与GA信号转导途径无关。据此,我们认为DD1是一个GA缺陷型矮化突变体。内源激素水平测定结果表明突变体中的GA和IAA的含量均显著下降,而ABA和BR的含量并末发生显著变化。
由于突变表型与潮霉素抗性连锁,我们采用TAIL-PCR方法鉴定了T-DNA的插入区域。序列分析表明在T-DNA插入位置下游有一个预测与GA失活相关的GA-2氧化酶基因OsGA2ox6,半定量RT-PCR和Real-Time PCR结果表明在突变体中OsGA2ox6基因的表达量显著提高。从而克隆了该基因,并制备了基因编码蛋白的抗体,Western杂交结果显示DD1突变体中OsGA2ox6蛋白含量明显提高。RNAi和过表达实验表明显性矮杆表型是由于35S增强子的插入导致OsGA2ox6基因过表达引起的。系统进化树分析表明OsGA2ox6蛋白属于GA-2氧化酶家族中的第Ⅲ类亚家族,该类家族成员蛋白以C20GA为反应底物。利用Northern杂交对OsGA2ox6基因表达谱作了分析,发现该基因主要在水稻的幼穗中高表达,在茎杆中也有表达,但表达量相对较低,预示OsGA2ox6基因可能与水稻穗分化及种子发育相关。GFP融合蛋白转染洋葱表皮细胞及拟南芥原生质体细胞结果显示OsGA2ox6蛋白是一个组成型表达蛋白。我们对突变体中GA合成代谢途径中一些关键酶编码基因的表达进行了分析,发现突变体中与GA合成相关的基因OsGA20ox2及OsGA3ox3的表达量提高。外源激素处理实验表明OsGA2ox6基因的表达受多效唑的正调控,并受GA3的负调控。
遗传效应分析表明,该矮杆基因表现为显性半矮杆遗传,且无明显连锁的不良遗传效应,符合生产上推广应用的要求。由于该基因是显性遗传,在育种过程中可显著缩短育种年限,提高育种效率,尤其是该基因在杂种F1中无超高效应,因而可在水稻杂种优势的利用中发挥其独特的作用,这也正是育种家所致力寻求的理想矮杆资源。该基因的克隆及功能分析也为揭示水稻矮化的分子机理提供了重要线索。