【摘 要】
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肿瘤抑素氨基末端的54-132位氨基酸(Tum-5)和C-端的185-203位氨基酸分别具有抗血管生成和抗肿瘤细胞活性，但肿瘤抑素是肺出血综合症的致病抗原且分子量大不能直接用于人体。为
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肿瘤抑素氨基末端的54-132位氨基酸(Tum-5)和C-端的185-203位氨基酸分别具有抗血管生成和抗肿瘤细胞活性，但肿瘤抑素是肺出血综合症的致病抗原且分子量大不能直接用于人体。为开发一种具有临床应用价值的同时具有抗血管生成活性和抗肿瘤细胞活性的肿瘤抑素相关肽，利用-GG-柔性Linker将这两个最小活性片段连接并构建了pTYB2-T42重组质粒，通过原核表达出可溶性肿瘤抑素相关T42肽，研究其在体外及体内的抗肿瘤活性。
方法：人工合成肿瘤抑素75-95位氨基酸(21肽)和185-203位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列，在21肽中新构建了RGD序列(CGTGGAGAT)，利用-GG-将两个片段连接并重组入质粒pTYB2，酶切和DNA测序鉴定插入片段的大小、方向及序列的正确性后，将构建成功的pTYB2-T42质粒转化到大肠杆菌表达载体BL-21(DE3)中，IPTG诱导产生融合蛋白的高效表达，几丁质亲和层析柱纯化后经Tricine-SDS-PAGE鉴定T42肽。利用MTT法、HE染色、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光染色、划痕修复实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管(CAM)抑制实验、小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤模型抑瘤实验并结合组织病理切片及免疫组化检测CD34和Ki67的表达来研究T42肽的生物学活性。
结果：经酶切和测序，证明pTYB2-T42载体含有大小、方向及序列正确的T42肽基因片段，表达的融合蛋白经几丁质亲和层析一步获得可溶性肿瘤抑素相关T42肽，其相对分子质量与理论大小一致。浓度为10-200μg/ml的T42肽对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人SGC-7901胃腺癌中分化细胞和宫颈癌Hela细胞有明显抑制作用且呈剂量依赖性，IC<,50>分别为45μg/ml、51μg/ml和53μg/ml。HE染色、AO/EB荧光染色结果表明，经过40μg/ml的T42肽作用24小时后的HUVECs和人SGC-7901胃腺癌中分化细胞细胞表现出一系列凋亡细胞特征性的形态变化，如细胞皱缩呈圆形或卵圆，深染，染色质边集。划痕修复实验显示40μg/ml的T42肽单独作用48小时可明显抑制人脐静脉内皮细胞、人SGC-7901胃癌细胞的迁移，对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用，在小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤模型中抑瘤率达到50.52％。病理切片HE染色显示T42肽组肿瘤的血管生成明显减少，坏死灶增多，免疫组化显示T42肽组CD34和肿瘤增殖抗原Ki67的表达明显少于对照组(P<0.05)。
结论：成功构建了pTYB2-T42重组质粒，肿瘤抑素相关T42肽具有显著的抗肿瘤活性，为肿瘤治疗开拓了广阔的前景。
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