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高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，严重威胁着人类的健康。天然降血压肽能够有效降低血压，且具有特异性强兼毒性低的特点，这使其具有潜在的应用价值。目前已知的主要降压途径包括RAS系统、氧化应激、炎症反应和血管内皮功能这四个途径，然而大多降血压肽的研究多集中于体外试验以及单一的降压途径。带鱼作为中国四大水产经济鱼类之一，含丰富的肌球蛋白。许多研究表明，肌球蛋白是制备活性肽的理想蛋白源。因此，本研究以带鱼鱼肉肌球蛋白为研究对象，以ACE抑制活性为指标，通过优化酶解条件，制得高ACE抑制活性的带鱼鱼肉肌球蛋白肽；采用高血压动物模型，研究其体内降血压作用及机理；采用柱层析纯化肌球蛋白肽，得到两条高ACE抑制活性的多肽并分析氨基酸序列；采用分子模型以及细胞试验，研究纯化后的两条多肽对RAS系统、氧化应激、炎症反应和血管内皮功能途径的影响，阐明带鱼鱼肉肌球蛋白肽降血压的主要分子机理。实验研究结果如下：
(1)以带鱼鱼肉为原料提取肌球蛋白，以ACE抑制活性为指标，筛选出胰蛋白酶作为水解带鱼鱼肉肌球蛋白的主要酶类，所制备的蛋白酶酶解液ACE抑制活性最高。以ACE抑制活性为指标，对带鱼鱼肉肌球蛋白的酶解条件进行单因素试验以及响应面试验优化，在酶底比为2%，pH为8，酶解温度为40℃，酶解时间为5h的条件下ACE抑制率为93.46%。将酶解液用超滤初步纯化，发现小于3kDa的酶解液ACE抑制活性最高，其IC50值为0.237mg/mL，表明所获得的具有ACE抑制活性的带鱼鱼肉肌球蛋白肽为小分子多肽。
(2)以高血压的SHRs为动物模型，研究带鱼鱼肉肌球蛋白肽的体内降血压作用和机理。短期和长期的降压结果显示，给药高剂量带鱼肌球蛋白肽4h后能显著降低SHRs的收缩压至156±5.49mmHg，在长期给药过程中降压效果稳定，能够长时间维持大鼠血压处于相对较低的水平，却对正常WRs血压无显著影响。带鱼肌球蛋白肽对SHRs和WRs的心率影响不显著，能够有效改善大鼠血浆内影响血压的相关因子缓激肽、HDL-C、LDL-C、TC、TG、Na和K的含量。通过对RAS系统、氧化应激和炎症反应途径中相关物质的表达进行分析，结果显示高剂量带鱼鱼肉肌球蛋白肽能减少SHRs血浆内AngⅡ含量至262.01±15.93pg/mL，改善RAS系统；显著下调氧化应激中硝基酪氨酸在SHRs肾脏和主动脉中表达，抑制氧化应激发生；降低血管粘附分子ICAM-1和VCAM-1在血管中的表达，抑制炎症反应；显著下调肾脏和血管中COLⅠ的表达，减缓组织纤维化的发生。且带鱼鱼肉肌球蛋白肽能够提高血管eNOS的表达，增加血管舒张物NO的含量，修复基于NO上调的血管舒张功能。WRs的组织切片试验显示，长期给药高剂量的带鱼肌球蛋白肽后WRs大鼠肝脏组织变化不显著，表明其不具有毒性作用。动物试验结果显示带鱼鱼肉肌球蛋白肽具有显著的体内降血压作用，并初步阐明其多条途径降血压机理。
(3)采用RP-HPLC柱层析纯化带鱼鱼肉肌球蛋白肽，经3次柱层析纯化后收集得到纯度较高的两个组分为P7-2-a和P9-2-b。用LC-MS/MS以及搜库法对两个组分的氨基酸序列进行分析，得到一条分子量为1060.52Da、氨基酸序列为ANSEVAQWR的多肽(A肽)，以及一条分子量为1016.57Da、氨基酸序列为EALVSQLTR的多肽(E肽)。用denovo法对氨基酸序列进行验证，与搜库法所得氨基酸序列一致，表明纯化得到的两条多肽氨基酸序列具有高度的准确性。将A肽和E肽序列对比Biopep和Antihypertensivepeptide数据库，得出A肽和E肽均为首次发现的新型ACE抑制肽，它们的IC50值分别为89.58μM以及91.48μM，活性较高。
(4)利用分子对接模型和细胞试验研究A肽和E肽的降血压分子机理。降压试验结果表明，A肽和E肽分别能在给药6h后显著降低SHRs的收缩压至140.1±7.3mmHg和167.1±7.1mmHg，即A肽和E肽均具有体内降血压活性。分子对接模型结果显示，A肽能通过11个氢键与ACE结合，且能通过S1和S2活性口袋与ACE相互作用；E肽通过9个氢键与ACE结合，且仅通过S2活性口袋与ACE相互作用，其结合作用弱于A肽。SPR验证试验表明A肽与ACE结合强度强于E肽，与分子对接模型结果一致，说明A肽和E肽的ACE抑制活性取决于它们与ACE的结合强度以及与ACE活性口袋的相互作用。从SHRs肺部毛细血管内皮中培养原代内皮细胞，通过MTT试验确定了细胞给药浓度为50μg/mL，处理时间为24h。从细胞的RAS系统、氧化应激以及炎症反应途径研究A肽和E肽的降血压分子机制，结果显示A肽和E肽分别能降低内皮细胞内AngⅡ含量至131.54±18.28pg/mL和204.4±34.74pg/mL、分别降低促氧化因子MDA含量至3.48±0.35nmol/mL和4.22±0.57nmol/mL，并降低促氧因子ROS、硝基酪氨酸、COLⅠ的表达以及提高抗氧化因子GSH、SOD、CAT的表达，显著下调炎症因子TNF-α以及相关粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达。对内皮细胞的功能性研究发现，A肽和E肽均能显著提升血管内eNOS表达，提升NO含量并抑制ET-1的表达，有效改善血管舒张功能。通过大鼠离体血管张力试验，进一步确认了A肽和E肽能够修复基于NO上调的血管舒张功能。揭示了A肽和E肽能通过多途径共同作用而起到降血压功效。
(1)以带鱼鱼肉为原料提取肌球蛋白，以ACE抑制活性为指标，筛选出胰蛋白酶作为水解带鱼鱼肉肌球蛋白的主要酶类，所制备的蛋白酶酶解液ACE抑制活性最高。以ACE抑制活性为指标，对带鱼鱼肉肌球蛋白的酶解条件进行单因素试验以及响应面试验优化，在酶底比为2%，pH为8，酶解温度为40℃，酶解时间为5h的条件下ACE抑制率为93.46%。将酶解液用超滤初步纯化，发现小于3kDa的酶解液ACE抑制活性最高，其IC50值为0.237mg/mL，表明所获得的具有ACE抑制活性的带鱼鱼肉肌球蛋白肽为小分子多肽。
(2)以高血压的SHRs为动物模型，研究带鱼鱼肉肌球蛋白肽的体内降血压作用和机理。短期和长期的降压结果显示，给药高剂量带鱼肌球蛋白肽4h后能显著降低SHRs的收缩压至156±5.49mmHg，在长期给药过程中降压效果稳定，能够长时间维持大鼠血压处于相对较低的水平，却对正常WRs血压无显著影响。带鱼肌球蛋白肽对SHRs和WRs的心率影响不显著，能够有效改善大鼠血浆内影响血压的相关因子缓激肽、HDL-C、LDL-C、TC、TG、Na和K的含量。通过对RAS系统、氧化应激和炎症反应途径中相关物质的表达进行分析，结果显示高剂量带鱼鱼肉肌球蛋白肽能减少SHRs血浆内AngⅡ含量至262.01±15.93pg/mL，改善RAS系统；显著下调氧化应激中硝基酪氨酸在SHRs肾脏和主动脉中表达，抑制氧化应激发生；降低血管粘附分子ICAM-1和VCAM-1在血管中的表达，抑制炎症反应；显著下调肾脏和血管中COLⅠ的表达，减缓组织纤维化的发生。且带鱼鱼肉肌球蛋白肽能够提高血管eNOS的表达，增加血管舒张物NO的含量，修复基于NO上调的血管舒张功能。WRs的组织切片试验显示，长期给药高剂量的带鱼肌球蛋白肽后WRs大鼠肝脏组织变化不显著，表明其不具有毒性作用。动物试验结果显示带鱼鱼肉肌球蛋白肽具有显著的体内降血压作用，并初步阐明其多条途径降血压机理。
(3)采用RP-HPLC柱层析纯化带鱼鱼肉肌球蛋白肽，经3次柱层析纯化后收集得到纯度较高的两个组分为P7-2-a和P9-2-b。用LC-MS/MS以及搜库法对两个组分的氨基酸序列进行分析，得到一条分子量为1060.52Da、氨基酸序列为ANSEVAQWR的多肽(A肽)，以及一条分子量为1016.57Da、氨基酸序列为EALVSQLTR的多肽(E肽)。用denovo法对氨基酸序列进行验证，与搜库法所得氨基酸序列一致，表明纯化得到的两条多肽氨基酸序列具有高度的准确性。将A肽和E肽序列对比Biopep和Antihypertensivepeptide数据库，得出A肽和E肽均为首次发现的新型ACE抑制肽，它们的IC50值分别为89.58μM以及91.48μM，活性较高。
(4)利用分子对接模型和细胞试验研究A肽和E肽的降血压分子机理。降压试验结果表明，A肽和E肽分别能在给药6h后显著降低SHRs的收缩压至140.1±7.3mmHg和167.1±7.1mmHg，即A肽和E肽均具有体内降血压活性。分子对接模型结果显示，A肽能通过11个氢键与ACE结合，且能通过S1和S2活性口袋与ACE相互作用；E肽通过9个氢键与ACE结合，且仅通过S2活性口袋与ACE相互作用，其结合作用弱于A肽。SPR验证试验表明A肽与ACE结合强度强于E肽，与分子对接模型结果一致，说明A肽和E肽的ACE抑制活性取决于它们与ACE的结合强度以及与ACE活性口袋的相互作用。从SHRs肺部毛细血管内皮中培养原代内皮细胞，通过MTT试验确定了细胞给药浓度为50μg/mL，处理时间为24h。从细胞的RAS系统、氧化应激以及炎症反应途径研究A肽和E肽的降血压分子机制，结果显示A肽和E肽分别能降低内皮细胞内AngⅡ含量至131.54±18.28pg/mL和204.4±34.74pg/mL、分别降低促氧化因子MDA含量至3.48±0.35nmol/mL和4.22±0.57nmol/mL，并降低促氧因子ROS、硝基酪氨酸、COLⅠ的表达以及提高抗氧化因子GSH、SOD、CAT的表达，显著下调炎症因子TNF-α以及相关粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达。对内皮细胞的功能性研究发现，A肽和E肽均能显著提升血管内eNOS表达，提升NO含量并抑制ET-1的表达，有效改善血管舒张功能。通过大鼠离体血管张力试验，进一步确认了A肽和E肽能够修复基于NO上调的血管舒张功能。揭示了A肽和E肽能通过多途径共同作用而起到降血压功效。