【摘 要】
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根据已报道的鸡白细胞介素-15(ChIL-15)的cDNA序列设计特异性引物,从科宝鸡的脾脏分离淋巴细胞,提取脾淋巴细胞的总RNA并以之为模板进行RT-PCR.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳
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根据已报道的鸡白细胞介素-15(ChIL-15)的cDNA序列设计特异性引物,从科宝鸡的脾脏分离淋巴细胞,提取脾淋巴细胞的总RNA并以之为模板进行RT-PCR.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后回收,并与克隆载体pGEM-T easy连接后,转化E.coliDH5α,在含氨苄青霉素的LB平板上选择培养后挑取白色菌落于LB液体培养基中振荡培养.用此培养物作模板,进行PCR鉴定.将PCR鉴定为阳性的转化单菌落接种于LB培养基中,过夜培养后抽提质粒用EcoRI进行酶切鉴定.取阳性克隆进行测序分析.测序结果表明PCR产物(cDNA)全长655bp,其中第84-644位是该基因的阅读框架(ORF),由561bp组成,编码187个氨基酸.经DNAsist V1.02比对分析,所克隆基因与GenBank中收录的鸡ChIL-15基因序列(cDNA)完全同源,表明成功克隆获得了鸡白介素-15基因.DNAsist分析表明,所克隆基因编码的蛋白质分子量为22KD,等电点为8.6.以克隆的cDNA序列中的ORF序列为基础,用DNAsist设计引物,以E.coli DHα(pGEM-T-easy-ChIL-15)为模板克隆ChIL-15的ORF,与载体质粒pET-32a(+)连接.连接产物转化宿主细菌E.coli BL21(DE3),再进行PCR和酶切鉴定以及测序鉴定.将阳性转化菌落进行IPTG诱导表达,提取包涵体,经SDS-PAGE分析显示所表达融合蛋白的分子量约为40kDa.在诱导1小时之后即开始大量表达,诱导4小时后表达量达最大,约占菌体总重量的13.8%.经脾淋巴细胞转化试验(MTT法)检测,表明所表达的重组ChIL-15有明显的刺激淋巴细胞转化活性.以表达的rChIL-15与新城疫疫苗联合使用,初步探讨了rChIL-15对疫苗免疫的增强作用.试验结果表明rChIL-15对新城疫疫苗免疫有显著的增强作用.联合应用rChIL-15的情况下,无论高剂量、中剂量或低剂量,其特异性抗体水平均显著高于ND疫苗免疫对照组,且能更早达到抗体水平高峰期,并维持更长时间的高水平持续期.提示rChIL-15具有增强鸡体免疫反应、提高抗体水平的功能,可能具有潜在的免疫佐剂应用前景.
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黄连(Rhizoma Coptidis)为常用的清热燥湿中药,历代本草记载含有黄连的方剂较多,其临床应用亦较为广泛,但在用法用量上缺乏明确规范,导致由于长期、过量或不恰当使用黄连而出现不良反应的现象时有发生,因此近年来有关黄连安全性的争议颇多。本研究采用中药毒理学方法对黄连进行了系统的基础毒性研究,包括黄连对小鼠的半数致死量(LDso)、毒性靶器官及剂量-毒性关系等,以期为黄连在临床的合理使用提供
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