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免疫调节能够维持免疫系统稳定,如果免疫调节失控,免疫系统的平衡被打破,宿主可能罹患癌症、各种自身免疫性疾病,因此免疫调节至关重要。灵芝(Ganodermalucidum)和牛樟芝(Taiwanofunguscamphorata)是我国传统中药。在临床应用中,灵芝、牛樟芝物能够改善免疫调节而对癌症、各种自身免疫性疾病等有很好的疗效。1989年,真菌免疫调节蛋白(FungalImmunomodulatoryProtein)的发现更是对灵芝、牛樟芝等大型真菌在临床应用的有力支持。真菌免疫调节蛋白是一类由一百多个氨基酸构成的小分子蛋白,具有多种促进免疫调节的功能。然而,这些蛋白改善免疫调节的机制却并不清楚。本研究希望能够获得灵芝真菌免疫调节蛋白LZ-8的蛋白晶体结构,并对牛樟芝真菌免疫调节蛋白FIP-aca进行外源表达的初步研究。
通过提取赤芝的LZ-8目的蛋白基因,利用PCR方法进行目的基因的扩增,并将其克隆到pET21a表达载体上。通过菌物PCR鉴定,双酶切鉴定以及测序鉴定证明表达克隆构建成功。将表达克隆转化入宿主细胞,对LZ-8蛋白进行试表达,证明LZ-8可以利用大肠杆菌原核表达系统表达而且所目的蛋白是可溶性蛋白。利用大肠杆菌表达系统进行蛋白的大量表达,并通过超声破碎法得到大量的可溶性目的蛋白LZ-8。将经过亲和层析纯化的蛋白,浓缩后再进行分子筛凝胶层析纯化。目的蛋白在Superdex75(HiLoad16/60)凝胶柱约75ml处被洗脱下来,通过分子量推测表达的LZ-8蛋白是二聚体蛋白。之后目的蛋白进一步进行离子交换层析,得到较多而且纯度较高的LZ-8。纯化后的LZ-8蛋白浓缩到5、10、15mg/ml三个浓度利用悬滴气相扩散法进行蛋白晶体生长条件的初筛,最终在20多个条件下获得了蛋白晶体,初筛时的晶体个体较小,单晶少,蛋白点衍射率较低。之后用其中的较好的条件进行优化,并设计了优化矩阵,最后在0.6M酒石酸钟钠沉淀剂、pH7.5Bis-trispropane缓冲液的条件下得到个体较大、形状较规则的单个蛋白晶体,并且最终获得3.2(A)的晶体结构数据。
对于牛樟芝免疫调节蛋白FIP-aca,合成了该蛋白的基因,通过分子克隆技术将其克隆到了pGEX-6p-1表达载体上,通过菌物PCR鉴定,双酶切鉴定以及测序鉴定证明表达克隆构建成功。利用大肠杆菌原核表达系统,能够大量表达可溶性的GST融合蛋白。利用PSP酶对GST标签进行切割,只有少量标签被切除,切割效果不佳,通过分子筛凝胶层析和离子交换凝胶层析也无法得到大量的可溶性FIP-aca目的蛋白。另外,还对免疫蛋白MICA进行了原核表达和复性。大肠杆菌表达系统可以表达MICA蛋白的包涵体,通过透析复性最终可拿到可溶性MICA蛋白。