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寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）是一种代表性的捕食线虫真菌（NTF）,它能产生粘性三维菌网（捕食器官/捕器）捕捉线虫,捕器是NTF捕捉线虫的工具,也是它们从腐生向寄生生活模式转变的重要标志。在本论文中,我们通过基因敲除、生化和表型特征比较对寡孢节丛孢中MAPK和APSES家族蛋白的功能进行了鉴定,通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术对MAPK和APSES家族蛋白调控产孢和细胞壁合成等表型的机制进行了探讨;通过代谢组和转录组技术对寡孢节丛孢野生型（WT）菌株与?Ao Swi6突变菌株的代谢产物和基因表达差异进行了比较。本论文的研究结果进一步拓展了我们对G蛋白信号尤其是MAPK家族蛋白及APSES转录因子在寡孢节丛孢的生长、产孢、捕器形成等生物学过程中的功能了解,为进一步阐明NTF捕器形成和生活史转换机制奠定了良好的基础。主要研究结果如下:（一）寡孢节丛孢MAPK家族蛋白的功能研究通过基因组比较,在寡孢节丛孢的基因组中检索到了10个同源的MAPK家族蛋白,通过蛋白序列比对、保守结构域分析、和系统聚类分析,构建了寡孢节丛孢中的MAPK级联信号调控模型。与其它丝状真菌类似,寡孢节丛孢中存在四条MAPK级联信号调控途径,即Fus3、Slt2、Hog1及Ime2。1.Slt2-MAPK级联信号蛋白的功能分析Slt2-MAPK级联由Bck1、Mkk1和Slt2组成,通过基因敲除获得了寡孢节丛孢Ao Bck1和Ao Mkk1基因的敲除突变菌株（实验室前期已经获得Ao Slt2的突变菌株）,表型分析结果发现,与WT菌株相比,?Ao Bck1、?Ao Mkk1和?Ao Slt2突变菌株的生长减慢、气生菌丝显著减少、菌丝细胞中的细胞核数量也明显下降。突变菌株对高渗等逆境的敏感性增加,细胞壁的结构发生了破损。此外,突变菌株不能产生分生孢子和捕器,不能捕杀线虫。RT-PCR分析表明,突变菌株中与产孢、细胞壁合成、H2O2代谢等相关基因的转录水平均明显下调。2.Hog1-MAPK级联信号蛋白的功能研究Hog1-MAPK级联由Ssk2、Pbs2和Hog1组成,通过基因敲除,获得了寡孢节丛孢三个基因的敲除突变菌株。表型分析发现,与WT菌株相比,突变菌株的菌丝生长减慢,气生菌丝明显减少,但菌丝内隔膜明显增多。同时,突变菌株的产孢量显著下降,孢子萌发率降低;突变菌株对高渗等逆境的敏感性增加;此外,突变菌株产生的捕器数量增多,捕器中的电子致密体（EDB）数量增加。电镜观察发现?Ao Hog1突变菌株中存在大量的脂滴。3.Fus3-MAPK级联信号蛋白功能研究Fus-MAPK级联由Ste11、Ste7和Fus3组成,通过同源重组技术获得了Ao Ste7和Ao Fus3基因敲除突变菌株,表型分析发现,?Ao Ste7和?Ao Fus3突变菌株的气生菌丝减少、菌丝隔膜增多;?Ao Fus3突变菌株的生长变慢,菌丝出现明显的膨大现象。突变菌株的产孢量明显减少;同时,?Ao Fus3突变菌株的孢子梗发生了显著的变化。突变菌株对高渗等逆境的敏感性增加。?Ao Ste7突变菌株能够产生少量的捕器,而?Ao Fus3突变菌株不产生捕器,但产生了菌丝圈,菌丝圈中没有EDB的存在。4.Ime2-MAPK的功能研究通过基因敲除获得Ao Ime2敲除突变菌株,表型分析发现,突变菌株的生长减慢、气生菌丝稀疏、菌丝隔膜增多;菌丝和分生孢子中的细胞核数量减少。突变菌株的产孢量降低,产孢相关基因的转录水平下调。此外,突变菌株对高渗敏感,菌丝出现塌陷等变形现象;此外,突变菌株产生的捕器数量减少,且多数捕器的菌丝环不能闭合,捕器中的EDB数量减少。（二）APSES家族蛋白的功能研究通过基因组分析,在寡孢节丛孢中检索到了5种APSES同源蛋白（Ao Stu A、Ao Mbp1、Ao Swi6、Ao Bfp4和Ao Xbp1）,其中,Ao Stu A基因突变菌株已经由本课题前期构建,本论文重点对其余四种APSES蛋白的功能进行了鉴定。1.四种APSES蛋白的功能分析通过基因敲除获得了四种APSES蛋白编码基因的敲除突变菌株,表型分析发现,?Ao Mbp1和?Ao Swi6突变菌株菌丝生长均减慢、气生菌丝明显减少且部分菌丝膨大、菌丝隔膜增多;?Ao Swi6突变菌株中细胞核数量减少;?Ao Mbp1和?Ao Swi6突变菌株对高渗等逆境的敏感性增加;同时,?Ao Swi6突变菌株细胞壁结构发生变化,伏鲁宁体减少。线虫诱导实验表明,?Ao Mbp1和?Ao Swi6突变菌株产生捕器的数量明显减少,捕器中EDB的数量也减少;有趣的是,?Ao Mbp1突变菌株产生的捕器是平面的菌网,?Ao Swi6突变菌株的捕器主要聚集在线虫附近产生。此外,与WT菌株相比,?Ao Mbp1和?Ao Swi6突变菌株的胞外蛋白酶水解活性都明显下降。RT-PCR分析表明,?Ao Swi6突变菌株中与产孢、细胞壁合成、H2O2代谢等相关基因的转录水平均明显下调。与之相反,?Ao Bfp4和?Ao Xbp1突变菌株的表型和WT菌株比较没有明显的差异。2.寡孢节丛孢WT菌株和?Ao Swi6突变菌株的代谢组和转录组测序比较通过LC-MS对WT菌株和?Ao Swi6突变菌株的代谢产物进行了比较,发现它们代谢图谱和代谢产物都有显著的差异。通过RNA-seq对WT菌株和?Ao Swi6突变菌株在线虫诱导不同时间点的基因表达差异进行了比较,发现Ao Swi6基因缺失后,突变菌株在营养生长阶段和捕器形成-致病性阶段的转录水平都发生了很显著的变化,其中参与DNA复制、错配修复、碱基切除修复等途径在线虫诱导的三个时间点都持续上调。结合KEGG和GO富集分析预测了部分可能参与捕器形成和致病性相关的基因。3.Ao Swi6下游靶基因预测和互作蛋白分析基于转录组数据,对Ao Swi6下游的靶基因进行了预测,共预测到401个靶基因,其中有83个基因参与了细胞过程的调控。同时,对Ao Swi6互作蛋白进行了预测,通过酵母双杂交技术（Y2H）对Ao Swi6及部分蛋白的互作进行了检测,结果表明Ao Swi6与Ao Slt2、Ao Pkc等蛋白之间存在互作。本文的创新点:1.对寡孢节丛孢MAPK家族蛋白的功能进行了鉴定,通过RT-PCR对MAPK家族蛋白调控产孢及抗逆性等表型的机制进行了分析。2.对寡孢节丛孢四种APSES家族蛋白的功能进行了鉴定,通过转录组测序对WT菌株和?Ao Swi6突变菌株在线虫诱导不同时间点的基因表达差异进行了比较;同时,对Ao Swi6下游靶基因进行了预测,通过Y2H技术对Ao Swi6与Ao Slt2、Ao Pkc等蛋白的互作进行了检测。