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由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中最严重的真菌性病害。每年全球由于该病源菌导致的直接和间接损失超过10亿欧元。已有研究表明氮饥饿是病原菌侵入寄主早期阶段遇到的主要环境胁迫因子,缺乏氮源会导致病原真菌致病相关基因特异表达。利用体外氮饥饿液体培养条件能够模拟病原菌进入寄主植物早期面临的缺氮环境。P.infestans侵入寄主马铃薯的时候,能够分泌产生具Rx LR结构域的效应蛋白,这些效应蛋白被发现在该病原菌侵染寄主早期表达量升高,它们通过与寄主植物特异性位点相结合,改变了寄主细胞的防御系统并完成定殖,最终导致寄主植物丧失抗性。因此,发掘并深入研究该类效应蛋白对于揭示病原菌早期侵染特性具有重要意义。我们在前期研究中发现了一株马铃薯晚疫病菌株NOD-1,该菌株在氮饥饿液体培养条件下产生的分泌蛋白会导致马铃薯叶片出现明显的坏死病斑,说明该病原菌在缺氮培养条件下产生了强致病性分泌蛋白。但这些蛋白具有什么样的特性,其中是否具有Rx LR基序的效应蛋白均不清楚。本论文以实验室前期筛选到的马铃薯晚疫病菌株NOD-1在完全营养以及氮饥饿培养条件下产生的分泌蛋白为研究材料,利用模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）对其进行致病性分析,发现该菌株在氮饥饿液体培养条件下分别培养12d、22d时产生的分泌蛋白具有致病性。采用基于高通量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的非标记（Label-free）定量蛋白质组学技术,分别对这两个培养时间分泌蛋白差异性进行分析,从中筛选获得了3个在氮饥饿液体培养条件下表达上调并具Rx LR结构域的分泌型效应蛋白。经基因克隆、原核表达及蛋白纯化,从上述3个效应蛋白中获得了2个具生物活性的目标蛋白DONTI4和DOMQL8,结合致病性分析表明这两个蛋白均为致病相关的分泌型效应蛋白。论文研究取得的主要结果如下:1.氮饥饿对马铃薯晚疫病菌株NOD-1分泌型效应蛋白的诱导将NOD-1菌株的菌丝体分别转接到完全营养以及氮饥饿液体培养基中,并于17℃、150 rpm摇床震荡培养24d。在培养过程中每间隔2d取一次样,提取并纯化滤液中的分泌蛋白,采用浓度为1.0μg/μl的分泌蛋白致伤接种本氏烟叶片,72 h后对其病斑面积进行测定。结果发现在特定培养时间产生的分泌蛋白导致本氏烟形成病斑。其中完全营养条件下培养时间是16d,氮饥饿条件下培养时间分别是12d和22d,氮饥饿培养条件下最早12d就产生了致病性分泌蛋白,早于完全营养培养。致病力强弱分析结果表明氮饥饿条件下12d和22d产生的分泌蛋白接种后形成的病斑面积均大于完全营养条件下培养16d,其中氮饥饿条件下培养22d提取的分泌蛋白接种后形成的病斑面积是完全营养培养16d时病斑面积的2.0倍,是氮饥饿条件下培养12d时病斑面积的1.9倍。这一结果说明低氮胁迫环境能够诱导该病原菌致病相关基因的高表达,其中可能也包括了效应基因。利用本氏烟对NOD-1菌株产生的分泌蛋白进行致病性鉴定具有较好的区分度和稳定性,通过试验明确了NOD-1产生致病性分泌蛋白的关键时间点,为后续该菌株分泌型效应蛋白的筛选和鉴定奠定基础。2.NOD-1菌株在氮饥饿培养条件下具Rx LR基序的分泌型效应蛋白的筛选分别提取NOD-1菌株在完全营养以及氮饥饿条件下液体培养12d和22d产生的分泌蛋白,采用基于高通量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的非标记定量蛋白质组学技术（Label-free）对样品中的分泌蛋白进行鉴定。根据鉴定结果,利用生物信息学软件对差异表达的分泌蛋白进行分析,结果表明该菌株在Tq N22处理（氮饥饿培养22d）后获得的差异蛋白（包括共有差异蛋白及特异表达蛋白,下同）有146个,Tq N12处理（氮饥饿培养12d）后获得的差异蛋白有17个,前者是后者的8.59倍。CW22处理（完全营养培养22d）后获得的差异蛋白有96个,CW12处理（完全营养培养12d）后获得的差异蛋白有26个,前者是后者的3.69倍。对相同培养时间两种处理的结果对比后发现,CW12处理后获得的差异蛋白是Tq N12的1.53倍;Tq N22处理后获得的差异蛋白则是CW22的1.52倍。对比结果说明了培养22d时该病原菌分泌产生的差异蛋白数量高于培养12d,在氮饥饿培养条件下增幅更大。此外,Tq N12处理后分泌产生的差异蛋白数量少于CW12;但培养到22d的时候,Tq N22处理后分泌产生的差异蛋白数量则多于CW22。对这两种培养条件下NOD-1菌株分泌产生的效应蛋白进行分析,结果表明Tq N12与CW12共有差异表达的效应蛋白,以及在CW12中特异表达的效应蛋白各有1个。Tq N22和CW22共有差异表达的效应蛋白有14个,Tq N22中特异表达的效应蛋白有4个,CW22中特异表达的效应蛋白也有4个。其中DONQB4在氮饥饿条件下比完全营养条件下表达量上调2.27倍;DONTI4在氮饥饿条件下比完全营养条件下表达量上调2.63倍;DOMQL8仅在氮饥饿条件下特异表达。根据上述研究结果筛选获得DONQB4、DONTI4以及DOMQL8等3个在氮饥饿培养条件下表达量上调（包括特异表达）,并具Rx LR基序的分泌型效应蛋白。3.NOD-1菌株氮饥饿条件下分泌型效应蛋白基因功能验证及结构分析利用NCBI数据库检索获得上述3个效应蛋白的基因序列,应用Primer软件设计并合成引物,采用原核表达载体p ET28a对上述效应基因进行原核表达,将表达获得的融合蛋白进行Western blot检测,根据检测结果采用镍琼脂糖凝胶亲和层析技术进行蛋白纯化,最终获得了2个目标效应蛋白,即DONTI4和DOMQL8。将这两个效应蛋白接种本氏烟后引起明显的致病反应,对比病斑面积发现DONTI4引发的致病性强于DOMQL8。同时,将这两个蛋白接种马铃薯感病品种BM448,通过检测SOD、POD、CAT防御酶活,以及膜脂过氧化反应产物丙二醛（MDA）含量变化,推测DONTI4蛋白作用马铃薯感病品种BM448后表现为亲和互作,DOMQL8蛋白则表现为非亲和互作。对这两个蛋白结构进行分析表明2个效应蛋白均主要由α螺旋,β转角和无规卷曲组成,并且α螺旋的比例明显高于β转角。保守序列分析表明,2个蛋白的保守序列均不相同,所处的位点也不一样。SMART软件分析结果显示DONTI4蛋白质含有8个结构域,DOMQL8蛋白质含有3个结构域。这一结果为后续对这两个效应蛋白的功能进行深入研究奠定了基础。氮饥饿培养条件下能够诱导病原菌致病相关基因表达量升高,并引发寄主病害加重的研究已有报道。但针对致病疫霉在氮饥饿条件下菌丝生长规律及其产生致病蛋白的分泌特征却鲜有研究。本论文通过利用本氏烟对马铃薯晚疫病菌NOD-1产生的分泌蛋白致病性进行分析,明确了该菌株在氮饥饿胁迫条件下菌丝生长特性,以及液体培养22d为该菌株产生强致病性分泌蛋白的关键时间,揭示出缺氮胁迫环境下的特定培养时间,能够诱导该病原菌致病相关基因特异表达。利用非标记定量蛋白质组学技术,并结合生物信息学软件对该病原菌分泌蛋白进行鉴定及分析,结果表明在氮饥饿胁迫条件下有多个效应基因被诱导表达,最终筛选获得3个具Rx LR基序的效应蛋白,检索出这3个蛋白对应的基因序列,经基因克隆、原核表达以及纯化后,获得了2个具生物活性的目标效应蛋白DONTI4和DOMQL8,功能验证发现这两个异源表达的蛋白均为致病相关的分泌型效应蛋白。