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川芎嗪(tetra methyl pyrazine，TMP)是伞形科蒿本属植物川芎Ligusticumchuanxiong Hort根茎中分离提纯的一种生物碱为中药川芎的有效活性成分之一。目前已有很多文献报道TMP具有逆转肿瘤多药耐药的活性，但由于甲基易被氧化而导致其半衰期短、生物利用度低，限制其临床应用。为了克服其缺点，我们合成了一系列川芎嗪芪类衍生物并筛选出具有较好活性的DLJ14((E)-2-(2，4，-二甲氧基苯乙烯基)-3，5，6-三甲基吡嗪）。前期实验结果已经证实:DLJ14能逆转人慢性粒细胞性白血病耐阿霉素细胞株K562/A02和人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/A对阿霉素的耐药性。但是，DLJ14和阿霉素合用后提高阿霉素抗肿瘤作用的机制并没有完全阐明。本课题将进一步探讨川芎嗪芪类衍生物DLJ14和阿霉素合用对人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/A体内外增殖的抑制作用及作用机制。 首先，体外MTT实验表明:DLJ14和阿霉素合用能明显增强对MCF-7/A细胞的抑制作用，与阿霉素单用组比较有显著性差异。体内裸鼠荷瘤实验表明:与阴性对照组相比，DLJ14单用(4mg/kg，8mg/kg)和阿霉素(1mg/kg)单用对阿霉素耐药移植瘤的增殖抑制作用弱;而DLJ14(4mg/kg，8mg/kg)和阿霉素(1mg/kg)联合用药对阿霉素耐药移植瘤的生长有显著抑制作用，与阿霉素单用组相比具有显著的统计学意义。细胞周期实验显示DLJ14和阿霉素合用能将MCF-7/A细胞阻滞在G2/M期，该阻滞作用与升高P53蛋白和P21蛋白表达，降低CyclinA蛋白表达有关。Hoechst33258染色实验和AnnexinⅤ-FITC/Propidiumiodide(PI)双染实验结果表明:与单用阿霉素比较，DLJ14和阿霉素合用能显著诱导MCF-7/A细胞凋亡，呈现明显的染色质浓缩、聚集在核周边或核膜破裂的现象，晚期凋亡细胞数显著增多。Westernblotting检测凋亡相关蛋白表达，结果显示:Bax/Bcl-2比率、cleavedcaspase-9和cleavedcaspase-3蛋白量均明显增多。JC-1检测细胞线粒体膜电位和Westernblotting分别检测线粒体和胞浆中cytochromec蛋白量，结果显示:与单用阿霉素比较，DLJ14和阿霉素合用组去极化线粒体的细胞比例增多，即细胞线粒体膜电势降低，cytochromec从线粒体释放到胞浆，表明MCF-7/A细胞发生凋亡可能通过线粒体通路。进一步对细胞生长相关信号通路进行分析，结果显示DLJ14和阿霉素合用可抑制细胞EGFR和PI3K蛋白的表达及细胞存活信号EGFR和Akt的磷酸化，而对非磷酸化Akt蛋白的表达量无影响。上述结果表明DLJ14和阿霉素合用后可通过抑制EGFR/PI3K/Akt细胞存活信号通路来诱导线粒体介导的细胞凋亡，加强阿霉素的细胞毒作用。 其次，探讨了DLJ14对ABC超家族耐药相关蛋白P-gp和BCRP的影响。P-gp底物罗丹明123细胞内蓄积实验表明:与单用阿霉素比较，DLJ14和阿霉素合用组中罗丹明123的荧光强度明显增强，即罗丹明123外排减少，细胞内蓄积增多。细胞内ATP含量测定和细胞中Ca2+-Mg2+ATPase活性检测表明:与单用阿霉素比较，DLJ14和阿霉素合用组中ATP含量和Ca2+-Mg2+ATPase活性均显著降低。Westernblotting进一步分析显示:与单用阿霉素比较，DLJ14和阿霉素合用后能明显降低细胞中ERK、P-ERK、P-gp和BCRP蛋白的表达。上述结果表明DLJ14和阿霉素合用能通过抑制ABC超家族耐药相关蛋白P-gp和BCRP的功能和蛋白表达来发挥作用。 综上所述，DLJ14和阿霉素合用可通过抑制EGFR/PI3K/Akt细胞存活信号通路来诱导线粒体介导的细胞凋亡和抑制ABC超家族耐药相关蛋白P-gp和BCRP的功能和蛋白表达来发挥抗耐药肿瘤细胞生长作用。