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花生是最容易受黄曲霉毒素污染的农作物之一。花生黄曲霉毒素污染已成为严重影响花生产业继续发展和人类健康的世界性问题,受到世界各国的高度重视。培育抗性品种是解决花生黄曲霉污染问题最有效、最经济的控制方法,但对花生抗黄曲霉侵染及产毒机制,特别是与抗性相关蛋白至今尚未清晰,从面阻碍抗性品种的选育进程。
本研究以抗黄曲霉花生种质J-11、粤油20和感黄曲霉花生种质粤油7号和汕油523为材料,采用蛋白质组学技术分析:(1)收获前抗-感种质在干旱胁迫及黄曲霉菌侵染下花生种子蛋白质的差异表达,识别与抗黄曲霉相关的诱导特异表达蛋白质,分析其在种子抗黄曲霉机制中的作用；(2)吸涨花生种子蛋白质的差异表达。
结果表明:(1)在干旱胁迫下,与正常生长相比,抗性种质J-11和感病种质粤油7号中新诱导表达蛋白点分别为11和6个,上调表达4倍以上的蛋白点分别有15和7个,消失的点分别为6和5个,下调表达4倍以上的点分别为6和3个。在干旱胁迫和黄曲霉侵染下,J-11和粤油7号分别与其干旱胁迫进行对比分析,结果显示,J-11和粤油7号在黄曲霉侵染后新诱导蛋白质点分别有17和12个,表达量上调4倍以上的蛋白点分别为11和5个,消失的蛋白点为7和8个,表达量下调4倍的蛋白点均有4个。通过比较J-11和粤油7号黄曲霉诱导差异表达蛋白质,结果鉴定出38个仅在J-11中差异表达的蛋白点。选取J-11中黄曲霉诱导差异表达蛋白质和粤油7号中7个表达量较高的新蛋白点进行MALDI-TOP/MS分析和NCBI数据库检索,结果鉴定出17个蛋白质,包括谷氨酸脱羧酶、钙依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、核糖体蛋白、iso—Ara h3、过氧化物酶、蛋白质酶抑制因子以及一些未知功能蛋白质；另外28个蛋白点质谱分析和数据库检索还在进行中。抗-感品种中这些由黄曲霉胁迫诱导差异表达的蛋白质可能与其干旱环境下的抗黄曲霉差异有关,对它们功能的进一步研究将有助于深入了解干旱胁迫下花生抗黄曲霉机制。
(2)花生种子的含水量与种子感染黄曲霉的能力有很大的关系。当种子在半干状态(含水量20％)时,抗性种质J-11和感病种质粤油7号种子黄曲霉侵染率分别为62.0％和100％,黄曲霉毒素含量为352.24ppb和954.09ppb,而当,在吸涨状态(含水量达30％,J-11和粤油7种子的黄曲霉侵染率分别为21.4％和27.5％,黄曲霉毒素含量明显分别为60.17ppb和62.62ppb,均显著低于半干状态下种子黄曲霉侵染率和黄曲霉毒素含量,表明抗-感种质种子含水量在30％(吸涨状态下),其感黄曲霉率和黄曲霉毒素污染率显著降低,且抗-感品种间没有显著差异。采用SDS-PAGE比较抗-感种质在半干状态和吸涨状态下种子蛋白质图谱差异,结果表明:在吸涨状态下,J-11和粤油7号种子蛋白质的SDS-PAGE图谱存在较大差异,在吸涨状态下,抗.感种质均有5个蛋白质(35.5kDa、31.0kDa、28.3kDa、14.0kDa、10.0kDa)表达量明显增加。为了进一步确定差异蛋白质的性质,采用蛋白质双向电泳技术对抗感种质在半干状态和吸涨状态的差异蛋白进行分析,结果表明:与半干种子2-DE图谱相比,在吸涨状态下,J-11和粤油7号中表达量上调达4倍以上的蛋白质点分别有7和4个,表达量下调4倍以上点分别有8和6个,其中四个蛋白质(p16.2114.2kDa,p16.3028.2kDa,p14.8327.6kDa,5.9127.6kDa)在抗-感种质中均表现出相同的表达变化。LCQ-MS/MS质谱分析和NCBI数据库检索表明,四个蛋白质在片段序列上与过敏源Ara h1有较高的同源性,并对四个蛋白质与抗性的关系进行探讨。