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随着食品安全问题的日益突出以及饲用抗生素滥用问题的愈发严重,寻找安全无污染、高效稳定、广谱抗菌且能够规模生产的抗生素替代品已经迫在眉睫。作为动物机体免疫系统的组成部分,溶菌酶是天然的抗生素替代品,目前已被普遍应用在医药、生物科研、食品以及饲料等领域,前景非常广阔。然而,作为畜牧行业最重要的成员之一,猪还没有专用的溶菌酶产品。猪溶菌酶(Sus scrofa lysozyme,SSL)作为猪体内抵抗细菌性疾病的重要屏障,不仅具备传统C型溶菌酶的抗菌功能,还能抵抗胃蛋白酶的降解作用,是最理想的猪用抗生素替代品。然而,由于SSL的来源有限(主要通过猪胃组织的提取),加之其抗革兰氏阴性菌的能力较差,目前还没其相关应用的报道。本文利用基因工程的手段,通过微生物发酵的方法规模化生产SSL产品;同时利用胰蛋白酶对SSL水解结合一定的分离纯化技术,获得了可以杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽产品;然后利用基因修饰的方法,将SSL中抗菌肽的作用强化,得到了既保留SSL抗革兰氏阳性菌的性能,又可以杀灭革兰氏阴性菌的新型SSL产品。此外,还对新型SSL产品的抗菌机理进行了探究,为其工业化应用奠定理论基础。(1)根据NCBI网站的基因序列,化学合成了SSL的编码基因,并对其进行大肠杆菌宿主的密码子优化,在BL21(DE3)中成功得到了诱导表达。在最优的诱导条件(25℃,前培养时间3 h,利用0.8 mmol·L-1的IPTG诱导8 h)发酵后,通过对包涵体的洗涤、溶解、透析以及浓缩,最终获得了166.91±3.37 mg·L-1的SSL,比酶活力可达7950.42±226.67 U·mg-1。利用毕赤酵母X-33(pPICZαA)成功地表达了SSL基因,并比较了两种密码子的优化方法对SSL基因在毕赤酵母中表达的影响,发现“全局随机优化法”对其表达量的提高较为明显,最终获得了189.28±4.16 mg·L-1比酶活力为2845.38±124.19 U·mg-1的SSL产品,总蛋白表达量是原始基因表达量的2.63倍,而“一对一”优化法对其表达无明显改善。此外,组成型表达载体pGAPZαA和蛋白酶缺陷型宿主SMD1168H均无法达到野生型(诱导表达载体)X-33(pPICZαA)的表达水平。通过亲和层析或SSL的复性过程,结合超滤的纯化方法,得到了电泳纯的SSL产品。对其酶学性质和抗菌特性进行了研究,发现重组SSL的性质与其理论值基本一致:最适反应温度35℃、最适反应pH 6.0,说明利用微生物发酵的方法生产SSL是切实可行的。而通过对大肠杆菌和毕赤酵母表达系统生产SSL的过程进行比较分析,发现大肠杆菌表达系统的生产周期更短,得到的产品比酶活力更高,有助于对其性质开展进一步研究。(2)通过对SSL进行蛋白酶水解,产物的SDS-PAGE分析以及抗菌活性测定,发现SSL对胃蛋白酶的水解具有抗性;而胰蛋白酶的水解物具有最强的抗革兰氏阴性菌活性,其抗菌系数可达2.81,可杀灭99%以上的测试菌。利用凝胶过滤色谱和反相分离色谱的分离纯化,结合液质联用的分离与鉴定,得到了两种对革兰氏阴性菌具有抗菌活性的肽,其氨基酸序列分别为:G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K(LP)和A-W-V-A-W-K(SP)。经化学合成以后进行抗菌谱的测定,发现LP对革兰氏阴性菌具有抗菌活性,但是对革兰氏阳性菌却没有相应的作用;而SP既可以杀灭革兰氏阴性菌,也基本上保留了SSL的抗革兰氏阳性菌的能力。通过圆二色谱(Circular dichroism,CD)分析,Swiss-modeling结构模拟以及AFM检测,推测LP和SP的作用方式与具备螺旋-回环-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)结构域的抗菌肽类似:主要是通过改变靶细胞细胞膜的通透性来杀死细胞。但是它们作用的具体方式不同,LP可能是通过地毯式模型的作用方式,而SP则是可能借助于其α-螺旋结构在细胞膜上形成孔洞。(3)将本研究中分离得到的抗菌效果较好的抗菌肽SP的编码基因、含有SP的HLH的编码基因以及SP的六拷贝的6SP编码基因分别与SSL的编码序列的N端或C端进行融合,构建表达载体后发酵得到了既能保留SSL杀灭革兰氏阳性菌的能力,又具备SP的抗革兰氏阴性菌活性的新型溶菌酶产品。同等条件下,SSL的N端融合产物的抗菌活性要明显高于C端的融合产物。通过CD与Swiss-modeling分析发现,融合SSL的N端距离SSL的活性中心更近,可能与其作时用的底物结合有关。其中,N端融合产物6SP-SSL的抗菌活性最高。6SP的存在一方面提高了SP与靶细胞的接触几率,另一方面也提高了融合产物的疏水性,增加了其与靶细胞的结合能力。此外,SSL与SP的协同作用也有所体现,特别是作用于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923和大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922时。6SP-SSL的获得为C型溶菌酶的增效研究提供了一种简单、高效且广谱的途径。(4)通过原子力显微镜以及膜电势的检测发现,6SP-SSL的作用可以使靶细胞E.coli ATCC 10798的细胞壁结构发生破坏,其通透性得到改变从而使细胞内溶物流出,导致细胞死亡。这也是SSL与SP共同的作用机理,我们推测6SP-SSL作用于靶细胞时,首先通过SP的疏水性或其特殊的α螺旋构象在靶细胞的细胞壁上形成孔洞,让SSL有机会接触到其底物结合位点,然后发挥其溶菌机制。此外,基于相关试剂盒以及流式细胞仪的检测发现,6SP-SSL作用后的靶细胞中有细胞凋亡现象的发生,并且发生细胞凋亡的细胞比例与融合SSL的作用时间及其浓度有关。说明除了直接杀菌机理之外,6SP-SSL还可以通过诱发靶细胞的程序性细胞死亡(如细胞凋亡),从而达到杀灭靶细胞的效果。通过进一步的研究发现,6SP-SSL可以通过下调靶细胞(E.coli ATCC 10798)中mazE基因的转录而影响其正常表达,使得毒素-抗毒素系统中的毒素成分maz F得以积累,从而诱发细胞的程序性死亡。