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烟曲霉是一种腐生丝状真菌，能产生许多稳定性很好的酶，具有很强的纤维素分解能力，是纤维素酶的主要来源之一。真菌纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶（或外切葡聚糖酶）、β-葡萄糖苷酶及其他辅助酶或蛋白，但真菌如何降解木质纤维素以及纤维素降解相关蛋白的表达仍然是有待深入研究的课题。 在猪和禽的饲养中，玉米、小麦和大豆为主要饲料用粮，这些饲料用粮的细胞壁结构复杂，而猪和禽的消化道中又缺乏降解细胞壁纤维素的酶，有研究表明，在饲料中约有15-20％的多糖不能被降解，增加了肠道内容物的黏度，影响营养吸收;同时，由于植物细胞壁不能被降解，也影响了细胞内淀粉的完全释放，导致单胃动物的饲料粮利用率不高，据估计饲料粮的利用率仅有60-70％，未消化的饲料排出后还会污染环境。虽然人们已尝试在饲料中添加β-葡聚糖酶和木聚糖酶，以降低肠道内溶物的黏度、加速饲料的消化和吸收，但效果并不理想。 为了解不同植物纤维素的降解机制，获得有效的饲料用酶配方，本论文的研究分别以玉米、小麦以及大豆的细胞壁纤维素为唯一天然碳源培养烟曲霉，在转录水平和蛋白表达水平对烟曲霉的分泌蛋白组进行研究，以比较烟曲霉降解不同饲料用粮纤维素时其表达的纤维素酶系的异同，从而对饲料用酶进行指导，提高单胃动物的饲料粮吸收率，达到节约粮食和降低环境污染的目的。 本论文的创新点在于分别以玉米、小麦以及大豆的天然细胞壁纤维素为唯一碳源，在转录水平和蛋白表达水平对烟曲霉的分泌蛋白组进行研究，从而寻找有效的组合酶系。烟曲霉在以纤维素为唯一碳源的培养基中进行培养时，可观察到显著的水解环，证明了其纤维素降解活性。同时，我们在玉米、小麦以及大豆的细胞壁纤维素作为唯一碳源的培养基中，对烟曲霉降解纤维素的能力进行了检测，并通过扫描电镜进行了进一步分析。扫描电镜结果显示，烟曲霉的菌丝可以在这些不同的天然碳源的表面生长，这表明烟曲霉可以降解来源于玉米、小麦以及大豆细胞壁的木质纤维素。同时，分泌蛋白的SDS电泳分析结果显示，烟曲霉分泌的纤维素水解蛋白的分子量主要分布在25-80kDa，其等电点(pI)分布在4.5-9.0之间。利用活性胶染色对纤维素以及木糖的水解酶谱分析显示，不同碳源培养基中烟曲霉所产生的水解酶活性也存在着差异。我们的研究结果表明，烟曲霉可在玉米、小麦及大豆纤维素上生长，产生的纤维素酶有很好的pH稳定性和热稳定性，并且其纤维素酶系的表达与碳源及培养时间直接相关。对烟曲霉所产生的纤维素酶的活性进行分析发现，烟曲霉所表达的纤维素酶可同时在39℃和50℃保持较高活性。其中，纤维素酶、木糖酶以及果胶酶的酶活在50℃和在39℃保持一致，这也表明烟曲霉所产生的纤维素水解酶系在50℃仍保持着很好的热稳定性。 将烟曲霉在以玉米、小麦或大豆纤维素为唯一碳源的培养基中进行培养后，用iTRAQ定量分析以及mRNA分析对分泌蛋白质组进行研究，发现在烟曲霉分泌的约550种蛋白中，有约85种蛋白与纤维素降解有关，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、蛋白酶以及一些推测的蛋白。在这85种纤维素水解蛋白中，52％的蛋白与纤维素降解相关（其中30％为纤维素水解酶和糖基水解酶，22％为半纤维素酶）。这些检测到的纤维素水解蛋白中，包含内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切-β-1-3-葡聚糖酶、β-葡萄糖基转移酶等功能结构域的GH3、GH7、GH17、GH15、GH5、GH31、GH45、GH27、GH16家族占据了主要成分。此外，还有一些纤维素水解蛋白含有α-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶的功能结构域，如GH71、GH92、GH13、GH47家族等。 ITRAQ定量分析结果显示出在不同天然碳源条件下的纤维素酶表达差异。内切葡聚糖酶属于GH81、GH16、GH45家族，外切葡聚糖酶属于GH43、GH7 and GH6家族，这两种酶在iTRAQ分析中都表现为表达上调，同时我们还在烟曲霉中发现了三种不同的CBM家族蛋白:1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase B(gi|74670557)、endo-1，4-β-xylanase(gi|70992777)以及1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase C(gi|74668313)。此外，对不同纤维素降解酶的表达时序分析发现，不同的纤维素降解相关基因的在不同的时间点的表达不尽相同。对iTRAQ的结果中的23个基因进行分析发现，以玉米细胞壁为唯一碳源的培养基中，大部分的基因表达量在要比以小麦和大豆为唯一碳源的培养基高很多，例如1，4-β-D-glucan-cellobiohydrolyase(gi|74670557)、exo-β-1,3-glucanase(gi|70996120)、endopoly-galacturonaseA(gi|74671877)以及endopoly-galacturonase(gi|71002252)。mRNA的表达谱分析结果也暗示，烟曲霉分泌蛋白组中的纤维素酶相关蛋白的调节及表达与纤维素的复杂程度相关，纤维素降解蛋白的表达及调控与纤维素的来源相关。 本论文的研究说明在烟曲霉降解玉米、小麦或大豆纤维素时，内切葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡萄糖苷酶协同作用，不同的纤维素需要不同的纤维素酶系。根据本论文的研究结果，我们还模拟动物饲养的条件，针对玉米、小麦和大豆，对内源葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶的不同的协作模式进行了探讨，并分析了其最优的组合酶模式。以上研究初步揭示了烟曲霉的在不同天然底物下的纤维素诱导及调节模式，同时也针对动物饲料建立了新的组合纤维素酶体系以提高纤维素降解率，获得了针对玉米、小麦或大豆饲料的酶配方。 烟曲霉α-1，2-甘露糖苷酶(MsdS)对里氏木霉蛋白质分泌的影响 里氏木霉由于其良好的蛋白质外泌表达特性而广为人知，它可以分泌含有N-/O-糖链的糖基化蛋白。α-1，2-甘露糖苷酶在里氏木霉、烟曲霉以及青霉菌中基因序列具有高度保守性，并归属于class-Ⅰ甘露糖苷酶家族。Class-Ⅰ甘露糖苷酶会对α-1，2-连接的D-甘露糖进行切割，α-1，2-甘露糖苷酶是哺乳动物细胞N-糖链加工的关键酶，在真菌细胞壁的合成与组织过程中发挥重要的作用。当烟曲霉α-1，2-甘露糖苷酶基因（msdS）缺陷时，突变株发生细胞壁和极性生长缺陷。里氏木霉是对人无害的安全微生物，其分泌糖蛋白上的N-糖链结构为Man8GlcNAc2，与烟曲霉分泌糖蛋白上的N-糖链Man6GlcNAc2不同，但与烟曲霉msdS基因缺陷株的分泌糖蛋白上的N-糖链相同。 为研究N-糖链加工对里氏木霉蛋白质翻译后修饰及其胞内运输的影响，本研究将烟曲霉α-1，2-甘露糖苷酶基因msdS转入里氏木霉中。表达msdS基因的里氏木霉突变株中，其分泌糖蛋白上的N-糖链主要糖型由野生株的Man8GlcNAc2转变为Man7GlcNAc2。尽管突变株的细胞壁组分发生了变化，但细胞壁完整性未受影响;与此同时，突变株却表现出多出芽和随机分枝的表型。本论文的研究表明，N-糖链的加工可能在里氏木霉的某些糖蛋白的胞内分拣和极性运输方面起重要作用，从而对细胞壁的合成及细胞极性生长至关重要。我们的结果还说明，在里氏木霉中N-糖链相关的糖蛋白分拣运输机制与烟曲霉不同。