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Alzheimer病(Alzheimers disease，AD)，通常被称为老年痴呆症，该病的特点为隐匿性起病，记忆功能进展性丧失并伴有人格改变、思考、语言、计划能力、认知功能下降以及精神行为异常，最终完全丧失生活自理能力而死亡。AD为最常见的痴呆类型，且目前尚无有效治疗手段。随着我国逐步进入老龄化社会，该病的发病率逐年提高，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，研究该病的发病机制并找到可能的治疗方法势在必行。 细胞外淀粉样蛋白斑块沉积、神经纤维缠结、皮质及皮质下区神经元及其突触结构丧失是AD的三大病理特征。Aβ蛋白是淀粉样蛋白斑块的主要成分，Aβ蛋白的过量产生并在细胞外聚集形成淀粉样蛋白斑块。Aβ蛋白寡聚体对神经细胞的毒性被认为是AD患者神经元细胞凋亡的始动因素，是导致神经细胞丧失的主要原因，为AD独有的病理特征。 生理状态下，Aβ的前体蛋白(amyloid beta precursor protein，APP)在α-分泌酶的作用下通过非淀粉样蛋白途径分解。α-分泌酶在APP的Aβ结构域内的第16号氨基酸赖氨酸(Lys16)和17号氨基酸亮氨酸(Leu17)之间剪切APP产生可溶性的APPα和C83片段，C83片段进一步被γ-分泌酶剪切产生p3片段和APP胞内结构域，该途径中没有Aβ产生。在病理状态下，APP首先经过(beta amyloidcleavage enzyme1，BACE1)在1号氨基酸天冬氨酸(Asp1)之后剪切产生C99片段，随后γ-分泌酶在C99的跨膜结构域里剪切产生Aβ蛋白和APP C-末端片段。Aβ单体被分泌到胞外并不断聚集，导致淀粉样斑块形成。 BACE2(beta amyloid cleavage enzyme2)是BACE1的同系物，同属天冬氨酰蛋白酶家族，BACE2氨基酸序列与BACE1有75％相同。BACE2基因定位于21号染色体，开始BACE2被认为是能够处理APP并产生Aβ蛋白，是AD的“元凶”之一。研究发现，BACE2可以在APP第615号苯丙氨酸和第616号苯丙氨酸之间剪切产生APP C-末端片段C80，这个位点位于Aβ的结构域内，既不同于α-位点，又不同于β-位点，也和γ-位点不同，因此被称为θ位点(θ-site)，BACE2在θ-位点剪切APP从而排除Aβ蛋白的产生。 BACE2的非淀粉样蛋白途径处理APP使得其成为对AD进行药物或基因治疗的有效的靶点。目前对BACE2在AD发病分子机制中的作用还不清楚，虽然已发现提高细胞内源性或外源性的BACE2表达可有效降低Aβ蛋白的产生，但是通过何种手段实现这一作用并为AD的基因治疗提供可行性依据尚需进一步研究。本系列研究以此为出发点，分五个部分对BACE2在AD分子机制中的作用进行研究。 第一部分，目的:建立人BACE2蛋白持续稳定表达细胞株，研究BACE2生理状态下的半衰期。 方法:以人细胞cDNA为模板，克隆真核细胞表达BACE2的质粒。稳定转染HEK293细胞，使其在细胞内持续表达。经过抗生素筛选和蛋白表达的鉴定证明其正确性。对获得的细胞株采用放线菌酮抑制该细胞总蛋白合成，在不同时间点检测BACE2残余量，计算其半衰期。 结果:1.成功构建并鉴定BACE2持续表达细胞株。2.检测了BACE2在真核细胞生理状态下半衰期约为20小时。 结论: BACE2为相对较长寿命蛋白，为认识BACE2的生理代谢特点及后续试验的设计提供基础。 第二部分，目的:研究BACE2蛋白的降解途径，并通过阻断其降解提高BACE2在细胞内的表达，观察对APP剪切的影响。 方法:采用药物分别阻断泛素-蛋白酶体途径和自吞噬-溶酶体途径对BACE2表达的影响，从形态学角度进一步验证。采用药物功能阻断及基因敲除的方法研究其上游信号传导通路。阻断BACE2和APP持续表达细胞中BACE2的降解。 结果:1.BACE2是通过自吞噬-溶酶体途径降解。2.是巨自吞噬途径而不是分子伴侣介导的胞吞作用参与了BACE2进入溶酶体的信号传导过程。3.阻断BACE2的降解可提高BACE2的表达，从而提高APP非淀粉样蛋白途径的产物C80的表达。 结论:阻断BACE2的降解提高C80的表达可为AD的治疗提供新的认识。 第三部分，目的:研究BACE2和BACE1在处理共同底物APP的关系及机制，探究BACE2的在亚细胞结构的定位。 方法:BACE2和APPsw双持续稳定表达细胞株4EB2中提高BACE1的表达。BACE1和APPsw双持续稳定表达细胞株2EB2中提高BACE2的表达。蔗糖梯度离心法和细胞内免疫荧光双染法验证生理状态下BACE2的亚细胞定位。 结果:1.4EB2中提高BACE1的表达，对BACE2的剪切产物C80没有明显改变。2.2EB2中提高BACE2的表达，C80的表达量增加。3.BACE1和BACE2在不同pH值环境下稳定型不同，二者在细胞内的定位可能不同。4.蔗糖梯度离心法证实BACE2生理状态下定位于ER而成熟态的BACE1定位于Golgi复合体。5.细胞内免疫荧光双染再次验证BACE2定位于ER。 结论:BACE1和BACE2在处理共同底物APP时，二者不是单纯的浓度依赖的竞争性关系。BACE1和BACE2在细胞内定位不同造成了二者在处理相同底物APP时的先后顺序不同。 第四部分，目的:探究BACE2的亚细胞结构定位对其剪切产物的影响。 方法:分子克隆在ER内定位表达的BACE2和APP质粒，将这些质粒与表达野生型的BACE1质粒共转染细胞。 结果:1.只有BACE2可以剪切成熟态的APP和未成熟的APP，而BACE1只能剪切成熟的APP。2.在2EB2细胞中引入ER定位的BACE2，可显著提高C80的表达。3.同时将APP和BACE2表达限制在ER内，较野生型的BACE2和野生型APP共转染的细胞，C80水平显著提高。 结论:本研究证明了不仅改变BACE2的表达的量，改变BACE2在细胞内的表达位置同样能起到降低淀粉样蛋白途径产物的可能，对AD的基因治疗带来新的思维方式。 第五部分，目的:探究将外源性BACE2蛋白导入细胞内可行的方法，为AD的基因靶向治疗提供依据。 方法:设计表达BACE2活性片段与HIV病毒TAT穿膜结构域融合蛋白的质粒，采用生物工程技术将该质粒在工程菌内表达，提取纯化蛋白并鉴定其穿膜功能。将该蛋白导入模拟Swidish家族性AD分子机制的细胞模型2EB2细胞。 结果:1.成功实现了BACE2活性片段与TAT穿膜结构域重组基因片段质粒的分子克隆，在E.coli内表达合成了TAT与BACE2活性片段的融合蛋白。2.通过细胞内的实验证实该融合蛋白能成功穿透细胞膜，且显著升高AD分子机制细胞水平模型细胞的C80的表达量和降低细胞培养液中Aβ40、Aβ42的表达量。 结论:在分子水平模拟了引入外源性BACE2蛋白对AD分子机制的细胞模型的影响，为以后的动物实验打下基础，并为AD的基因靶向治疗提供理论依据。 本系列研究详细论证了BACE2蛋白的生理特征，代谢特点，细胞内定位，与BACE1剪切APP的关系，改变细胞定位对APP剪切的影响，合成了BACE2活性片段和穿膜序列融合蛋白并证实该蛋白能有效降低AD分子机制细胞水平模型细胞Aβ的产量。本文为深入了解AD发病机制提供新的认识，为AD可能的治疗方法提供理论依据。