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金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为兰科(Orchidaeeae)石斛属(Dendrobium Sw.)多年生附生草本植物,集观赏和药用价值于一身。由于人为过度采收及自然繁殖率低,导致金钗石斛野生种质资源遭受严重破坏,我国已将其列为珍稀濒危药用植物。本文对金钗石斛进行了ARMS鉴别及其微卫星标记的开发研究,有利于其种质资源的保存和遗传多样性的保护。
本文根据金钗石斛及其它10种石斛的rDNA ITS序列,设计出鉴别金钗石斛的两对ARMS引物,运用ARMS技术鉴别金钗石斛,并对这两对鉴别引物的效果作了比较。PCR扩增结果表明,在退火温度为64℃-65℃时,突变3端第三个碱基的引物在此温度范围内均可鉴别金钗石斛,扩增出长度约260bp的目的条带;而突变3’端第四个碱基的引物在68℃时才可鉴别金钗石斛。可见,前一对引物的鉴别温度范围更宽一些。因此,运用ARMS技术可以快速、有效地从石斛属植物中鉴别出金钗石斛,而且,其结果的稳定性、可靠性较好。
运用磁珠富集法开发金钗石斛的SSR分子标记。首先,构建小片段的基因组文库,用生物素标记的混合探针(AC)15、(AG)15与基因组文库DNA.选择性杂交,利用链霉亲和素包裹的磁珠富集含有微卫星DNA的片段,再进行克隆、测序。共分离了30条微卫星序列,其中,核心序列重复次数达10次以上的有26条,占总数的86.67%,并根据这些序列的特征进行分类;除了一些序列因自身结构原因,侧翼序列较短而不能设计引物外,设计了16对引物,通过PCR反应条件的优化,筛选出9对引物,扩增结果显示出多态性,可作为微卫星标记,进一步用于金钗石斛居群分子生态学的研究。