论文部分内容阅读
端粒酶是一种核糖核蛋白体(RNP)，RNA和蛋白质对其活性都是必需的，并且端粒酶利用内部的RNA模板指导端粒重复序列合成的机制是保守的。现在的观点普遍认为端粒酶可能通过维持端粒功能和(或)其它未知的方式促进肿瘤的发展。人类肿瘤细胞中广泛的存在较高的端粒酶活性，而在人类正常体细胞中并未检测到或仪有微弱的端粒酶活性，这种端粒酶活性分布极大的差异也使其成为当今肿瘤治疗中的一个热门靶点。
早期的研究发现在四膜虫、酵母及人的永生化细胞中引入带突变模板的端粒酶RNA亚基后会使得端粒末端的重复序列发生改变，而突变端粒酶活性的存在对细胞来说是有害的。迄今为止，有个别报道在端粒酶阳性的肿瘤细胞中引入带突变模板的人端粒酶RNA亚基(MT-hTR)后，细胞生长很快受到抑制，并且这种抑制效应的发生不依赖端粒长度的改变，也不依赖细胞最初的端粒长度或野生型p53的存在。MT-hTR在肿瘤治疗中的应用前景及其效应机制都有待继续探讨。
本研究旨在建立能够在肿瘤细胞中发挥指导突变端粒重复序列合成作用的MT-hTR真核表达重组体，并初步观察MT-hTR对人宫颈癌HeLa细胞生长的影响。
第一部分:MT-hTR表达体的构建
方法：
1、获得用于人端粒酶RNA亚基(hTR)真核表达的合适载体。
2、以HeLa细胞基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到野生型人端粒酶RNA亚基(WT-hTR)的编码基因。
3、将WT-hTR的编码基因插入表达载体Ul启动子的下游，构建WT-hTR的真核表达重组体。
4、以WT-hTR表达体为模板设计诱变引物，通过：PCR介导的定点突变得到四种带突变模板的人端粒酶RNA亚基(MT-hTR)的编码基因。
5、通过分子克隆的方法，构建四个MT-hTR的真核表达重组体。
结果：
1、测序证实构建的WT-hTR表达体的序列无误。
2、测序证实构建的四个MT-hTR表达体的序列均符合预期设计。
第二部分：MT-hTR表达细胞的建立及分析
方法：
1、将空载体、WT-hTR表达体及MT-hTR表达体分别与质粒pEGFP-C1通过脂质体共转染人宫颈癌HeLa细胞，通过药物G418的筛选，得到稳定表达外源基因的细胞。
2、提取各组细胞的总RNA，用RT-PCR的方法检测细胞中目的基因hTR的表达水平。
3、提取各组细胞的裂解物，用TRAP的方法检测细胞中端粒酶的活性。
4、MTT法绘制各组细胞的生长曲线。
5、MTT法和流式细胞术分析各组细胞对药物柔红霉素(DNR)的敏感性。
结果：
1、在转染细胞内检测到由重组体表达的WT-hTR或MT-hTR，成功获得对照组细胞及稳定表达WT-hTR或MT-hTR的实验组细胞。
2、各组细胞都具有较高的野生型端粒酶活性，并在MT1组细胞中检测到突变型端粒酶活性。
3、WT组细胞生长速度略快于对照组细胞；MT1、MT3及MT4组细胞的生长速度慢于对照组细胞；而MT2组细胞生长速度与对照组无显著差异。
4、0.05 μg／ml DNR处理48 h后，MT4组细胞的抑制率及凋亡率均显著高于对照组细胞，其余各组与对照组无显著差异。
结论：
1、成功构建了一个WT-hTR和四个MT-hTR真核表达重组体。
2、重组体在细胞内能成功表达目的基因，并且MT-hTR能与细胞内的TERT亚基结合，发挥指导突变端粒重复序列合成的作用。
3、在HeLa细胞内表达MT-hTR能抑制细胞的生长速度，并提高细胞对化疗药物柔红霉素的敏感性。