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研究背景:瘤胃内分子氢(H2)是伴随着瘤胃微生物降解饲草生成挥发性脂肪酸(Volatile fatty acids，VFA)的过程而产生，是甲烷菌生长增殖的重要前体物，最终代谢生成甲烷(CH4)。基于已糖降解生成VFA各组分的生物化学过程，不难发现生成乙酸、丙酸和丁酸各组分时释放的H2量相差很大，提示瘤胃内H2可能成为影响瘤胃发酵路径的重要中间体。同时，瘤胃内H2也是调控瘤胃甲烷生成的关键前体物。分子氢在瘤胃内有溶解态氢(Dissolved hydrogen，dH2)和气体态氢(Gas hydrogen，gH2)两种存在形态，但是仅仅dH2与瘤胃微生物接触，具有生物学功能。因测定方法的限制，瘤胃dH2相关研究非常少。本论文希望建立瘤胃内dH2浓度的测定方法，并在些基础上研究dH2与反刍家畜瘤胃功能的关联机制。为此，本博士论文含5个试验:其中前2个试验重点介绍体外和体内测定瘤胃液dH2的测定方法，后3个试验分别以藏绵羊、奶牛和山羊为试验动物，研究dH2与瘤胃功能的关联机制。 试验1本研究第一个目的是发明一种简单装置，用于测定发酵液中溶解态氢的浓度，并且评估测定溶解态氢浓度的准确性。第二个目的是本设备测定不同饲料饲草经体外模拟瘤胃发酵24 h后的溶解态氢的浓度，以及溶解态氢浓度与体外发酵参数之间的相关关系。McDougall缓冲液和超纯水的氢气Bunsen吸收常数分别为0.01705和0.01744，两者之间的差异小于3％。这说明，我们可以使用超纯水的氢气Bunsen吸收常数计算缓冲瘤胃液dH2浓度。发酵液dH2饱和系数大于1，说明发酵液dH2和gH2并不平衡，且dH2呈超饱和现象。发酵液dH2浓度升高有利于H2生成较少的发酵路径，致使VFA预测的H2生成效率降低。总之，发酵液中的dH2处于是超饱和状态，dH2浓度不能够利用发酵瓶顶端gH2浓度来预测，dH2可以影响甲烷生成及VFA发酵模式。 试验2:本研究第一个研究目的是比较口腔胃管插入深度和瘘管采样部位溶解气体和发酵终产物浓度的差异;第二个目的是测定瘤胃不同采样时间下溶解气体和发酵终产物浓度的差异。口腔胃管插入深度180和200 cm对瘤胃液dH2、pH、各VFA的摩尔比例和RNH2没有显著影响（P＞0.05）。瘘管采集不同瘤胃部位的瘤胃液中dCH4、总VFA浓度和pH值差异显著（P＜0.05）。与其它四个部位相比，前背盲囊(Cranial dorsal，CRD)瘤胃液的pH值最大和总VFA浓度最小（P＜0.05)。瘘管采集不同瘤胃部位的瘤胃液dCH4、总VFA浓度和pH值差异显著（P＜0.05）。与其它四个部位相比，CRD瘤胃液的pH值最大和总VFA浓度最小(P＜0.05)。口腔胃管和瘘管采集背囊(Central rumen，CR)瘤胃液的dH2浓度也具有强正相关(r=0.850，P＜0.001)。瘘管和口腔胃管采集瘤胃液的dH2同Ac/Pr(r=-0.768,P＜0.001)、Ac/Bu(r=-0.780,P=0.003)和RNH2(r=-0.767,P=0.004)存在负相关关系，同dCH4存在正相关关系（r=0.582，P=0.04）。总之，口腔胃管是一种有效方式来获取瘤胃液以测定瘤胃内dH2浓度，但是需要注意减少唾液污染。两种方法获取的数据都支持瘤胃内dH2浓度影响瘤胃发酵模式和甲烷生成的观点。 试验3:本研究第一个研究目的是，揭示瘤胃内溶解气体的超饱和现象。第二个研究目的是，研究饲喂藏绵羊两种纤维来源时，瘤胃内溶解态气体与气体态气体间的相关关系，以及对不同反应路径吉布斯自由能变化的影响。瘤胃内dH2和dCH4的饱和系数显著大于1，呈超饱和状态。溶解气体的饱和系数与溶解气体浓度呈正相关，且瘤胃内dH2饱和系数受到日粮影响显著。瘤胃dH2浓度同乙酸摩尔比例呈负相关(P=0.003)，同丁酸摩尔百分比呈正相关(P=0.001)。藏绵羊瘤胃发酵路径的吉布斯自由能变化（除反应路径4）受日粮纤维来源和吉布斯自由能变化估算方法影响显著（P＜0.05），但不受日粮和△G估计方法互作影响(P＞0.05)。与利用溶解态气体浓度预测值相比，利用溶解态气体测定值计算H2生成路径的吉布斯自由能变化更高，H2消耗路径的吉布斯自由能变化更低。总之，瘤胃内的H2和CH4都是超饱和的，同时dH2浓度同VFA组成和在CH4浓度密切相关。瘤胃内溶解气体浓度不能通过未被充盈空间气体组分浓度来预测，且影响发酵路径的吉布斯自由能变化的估算。 试验4:本研究目的是揭示奶牛摄入不同碳水化合物来源日粮会改变瘤胃环境，而且dH2浓度与瘤胃发酵模型改变和微生物种群变化有密切关系。饲喂4种日粮奶牛采食量(10.7 to12.6 kg/d)和纤维消化率(0.584 to0.692)有明显差异，使得胃肠道CH4排放（27.2 to37.3 g/kg OM消化率），dH2浓度（0.258 to1.64μmol/L）、瘤胃发酵终产物和微生物种群发生很大变化。瘤胃dH2浓度与乙酸摩尔比例(r=-0.65;P＜0.001)，真菌拷贝数（r=-0.44;P＜0.015）、Fibrobacter succinogenes丰度（r=-0.55;P=0.002）和胃肠道CH4排放量(r=-0.47;P=0.01)呈强负相关，与丙酸摩尔比例（r=0.45;P=0.02）、甲烷菌数量（r=0.60;P=0.001）、Selenomonas ruminantium(r=0.41;P=0.03)和Prevotella spp丰度（r=0.53;P=0.004)呈强正相关。另外，瘤胃dH2浓度与生成更多乙酸和H2化学方程的吉布斯自由能变化成正相关，与生成更多丙酸和更少H2化学方程的吉布斯自由能变化没有相关性。总之，瘤胃dH2浓度同发酵路径由乙酸型向丙酸型改变和微生物种群由纤维降解向淀粉分解物种改变密切相关。还有一个没有解决矛盾是，瘤胃dH2浓度升高导致甲烷菌数量升高但减少了胃肠道CH4排放。 试验5:本研究目的是瘤胃内增加溶解氢气对瘤胃发酵模式及瘤胃微生物种群结构的影响。与日粮添加氢氧化镁(Mg(OH)2)相比，日粮添加金属镁粉(Mg)改变瘤胃dH2浓度，改变瘤胃发酵模式和微生物区系。两个处理间的瘤胃Mg2+浓度无显著差异（P＞0.05）。日粮添加Mg增加了采食后2.5 h瘤胃dH2浓度(P＜0.05)，采食后2.5和6h瘤胃dCH4浓度(P＜0.05)。日粮添加Mg减少山羊日增重（P＜0.05）、总VFA浓度(P＜0.05)、乙丙比（P＜0.05）和真菌拷贝数(P＜0.05)，增加了丙酸摩尔比例（P＜0.05）、甲烷菌数量(P＜0.05)和胃肠道CH4排放量(P＜0.05)。两个处理间的细菌种群结构没有明显差异（P＞0.05）。瘤胃dH2浓度同乙酸摩尔比例和真菌拷贝数呈强负相关(P＜0.001)，同丙酸摩尔比例和甲烷菌数量呈强正相关(P＜0.001)。日粮添加金属Mg粉增加瘤胃dH2浓度，进而促使瘤胃发酵由乙酸型向丙酸型转变，增加胃肠道CH4排放量和抑制山羊生长。 全文结论:瘤胃液dH2是超饱和的，在dH2浓度不能通过发酵瓶顶端或瘤胃未被充盈空间的gH2浓度来预测。尽管瘤胃内dH2浓度（＜50μM）非常低，dH2与瘤胃发酵模式和微生物种群结构密切相关，可能成为影响家畜产品品质和胃肠道CH4排放的关键中间体。