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【背景与目的】
生精缺陷患者面临着永久性不育的困境，传统的治疗手段及辅助生殖技术尚无法解决他们的生育问题。基于干细胞的再生治疗方法从成体干细胞获得精原干细胞（SSCs），进而得到成熟精子，是目前治疗这类疾病的理想途径。我们的前期研究结果已经证实，人脐带间充质干细胞（HuMSCs）具有分化为男性生殖细胞的潜能，将HuMSCs移植到不育小鼠曲细精管中能够促进精子发生的恢复，但是诱导形成的生殖细胞均无法启动减数分裂发育为成熟精子。细胞的转分化受组织细胞特异性转录因子的调控，其中叉头样转录因子1（FOXO1）是维持雄性生殖细胞发育的重要调控因子，有研究表明生殖细胞增殖缺陷和分化障碍与FOXO1时序表达错乱或表达缺失密切相关。本研究拟通过外源性导入FOXO1诱导HuMSCs分化为男性生殖细胞，探讨FOXO1对HuMSCs转分化为男性生殖细胞的调控作用，为男性不育的治疗提供新的思路。
【材料与方法】
1.组织块贴壁法分离、培养、扩增HuMSCs；2.构建FOXO1过表达慢病毒质粒，包装及纯化后得到过表达FOXO1的慢病毒原液；3.将过表达FOXO1的慢病毒感染第三代HuMSCs，48h后用RT-qPCR及WB检测感染效率，使用潮霉素B进行药物筛选，药筛10d后得到稳定表达FOXO1的HuMSCs-FOXO1稳转株；4.倒置显微镜下观察HuMSCs-FOXO1的形态学变化；5.用CTG和EdU实验检测HuMSCs-FOXO1的增殖水平；6.用RT-qPCR检测HuMSCs-FOXO1的SSCs特异性标记物ID4的mRNA表达水平；7.予完全培养基培养HuMSCs-FOXO1，用RT-qPCR检测男性生殖细胞发育过程中各阶段的生物学标记表达情况；8.予男性生殖细胞条件培养基培养HuMSCs-FOXO1（以HuMSCs-FOXO1-CM表示），用RT-qPCR检测男性生殖细胞发育过程中各阶段的生物学标记表达情况。
【结果】
1.成功构建pLVX-hFOXO1-SV40-Hygro过表达慢病毒载体，包装及纯化后得到较高滴度的过表达FOXO1的慢病毒原液；建立过表达FOXO1的HuMSCs-FOXO1稳转株，倒置显微镜下见细胞分布均匀、形态变短；稳定过表达FOXO1后，HuMSCs的细胞增殖率显著降低（P<0.01），精原干细胞标记物ID4表达量增高；
2.FOXO1对HuMSCs转分化的调控作用：说明过表达转录因子FOXO1可以直接转分化HuMSCs，程序化表达男性生殖细胞发育各个阶段的生物学标记。
2.1原始生殖细胞标记：HuMSCs-FOXO1的原始生殖细胞标记物OCT4表达量在第3-10天是增高的，表达高峰在第3天；而SOX17表达量在1-3天是增高的，表达高峰在第1天。
2.2精原干细胞标记：HuMSCs-FOXO1的精原干细胞标记物ID4表达量在第1-7天以及第14天是增高的；而UCHL1表达量在第7-10天是增高的，表达高峰在第10天。
2.3减数分裂标记：HuMSCs-FOXO1的减数分裂标记物KIT表达量在第7-21天是增高的，表达高峰在第10天；而STRA8表达量在第7-21天是增高的，表达高峰在第7天。
2.4精子细胞标记：HuMSCs-FOXO1的圆形精子细胞标记物TNP2表达量在第21天是增高的；而长形精子细胞标记物PRM1表达量与对照组相比无明显变化。
3.研究男性生殖细胞条件培养体系对FOXO1转分化的调控作用：说明男性生殖细胞条件培养体系具有促进FOXO1转分化HuMSCs为男性生殖细胞的作用。
3.1利用CTG和EdU实验检测HuMSCs-FOXO1-CM的细胞增殖率显著降低（P<0.01）。
3.2原始生殖细胞标记：HuMSCs-FOXO1-CM的原始生殖细胞标记物OCT4表达量在第1天和第7天是增高的；PGC标记物SOX17表达量在1天以及第14-21天是增高的，表达高峰在第21天。
3.3精原干细胞标记：HuMSCs-FOXO1-CM的精原干细胞标记物ID4表达量在第1-21天均是增高的，表达高峰在第3天；而UCHL1表达量在10-21天是增高的，表达高峰在第21天。
3.4减数分裂标记：HuMSCs-FOXO1-CM的减数分裂标记物KIT表达量在第1天以及第7-14天是增高的，表达高峰在第14天；而STRA8表达量在第1-21天均是增高的，表达高峰在第7天。
3.5精子细胞标记：HuMSCs-FOXO1-CM的圆形精子细胞标记物TNP2表达量在第3天和第21天是显著增高的，表达高峰在第21天；而长形精子细胞标记物PRM1表达量在第7天和第21天是显著增高的，表达高峰在第21天。
【结论】
1.转录因子FOXO1可以直接转分化HuMSCs为男性生殖细胞。过表达FOXO1后，HuMSCs的干细胞多能性基因表达增高、细胞分化能力增强、减数分裂进程激活，程序化表达原始生殖细胞、精原干细胞、减数分裂、圆形精子细胞的生物学标记；
2.男性生殖细胞条件培养体系能够有效促进FOXO1转分化HuMSCs为男性生殖细胞，增强HuMSCs的程序性分化形成晚期生殖细胞的能力。
生精缺陷患者面临着永久性不育的困境，传统的治疗手段及辅助生殖技术尚无法解决他们的生育问题。基于干细胞的再生治疗方法从成体干细胞获得精原干细胞（SSCs），进而得到成熟精子，是目前治疗这类疾病的理想途径。我们的前期研究结果已经证实，人脐带间充质干细胞（HuMSCs）具有分化为男性生殖细胞的潜能，将HuMSCs移植到不育小鼠曲细精管中能够促进精子发生的恢复，但是诱导形成的生殖细胞均无法启动减数分裂发育为成熟精子。细胞的转分化受组织细胞特异性转录因子的调控，其中叉头样转录因子1（FOXO1）是维持雄性生殖细胞发育的重要调控因子，有研究表明生殖细胞增殖缺陷和分化障碍与FOXO1时序表达错乱或表达缺失密切相关。本研究拟通过外源性导入FOXO1诱导HuMSCs分化为男性生殖细胞，探讨FOXO1对HuMSCs转分化为男性生殖细胞的调控作用，为男性不育的治疗提供新的思路。
【材料与方法】
1.组织块贴壁法分离、培养、扩增HuMSCs；2.构建FOXO1过表达慢病毒质粒，包装及纯化后得到过表达FOXO1的慢病毒原液；3.将过表达FOXO1的慢病毒感染第三代HuMSCs，48h后用RT-qPCR及WB检测感染效率，使用潮霉素B进行药物筛选，药筛10d后得到稳定表达FOXO1的HuMSCs-FOXO1稳转株；4.倒置显微镜下观察HuMSCs-FOXO1的形态学变化；5.用CTG和EdU实验检测HuMSCs-FOXO1的增殖水平；6.用RT-qPCR检测HuMSCs-FOXO1的SSCs特异性标记物ID4的mRNA表达水平；7.予完全培养基培养HuMSCs-FOXO1，用RT-qPCR检测男性生殖细胞发育过程中各阶段的生物学标记表达情况；8.予男性生殖细胞条件培养基培养HuMSCs-FOXO1（以HuMSCs-FOXO1-CM表示），用RT-qPCR检测男性生殖细胞发育过程中各阶段的生物学标记表达情况。
【结果】
1.成功构建pLVX-hFOXO1-SV40-Hygro过表达慢病毒载体，包装及纯化后得到较高滴度的过表达FOXO1的慢病毒原液；建立过表达FOXO1的HuMSCs-FOXO1稳转株，倒置显微镜下见细胞分布均匀、形态变短；稳定过表达FOXO1后，HuMSCs的细胞增殖率显著降低（P<0.01），精原干细胞标记物ID4表达量增高；
2.FOXO1对HuMSCs转分化的调控作用：说明过表达转录因子FOXO1可以直接转分化HuMSCs，程序化表达男性生殖细胞发育各个阶段的生物学标记。
2.1原始生殖细胞标记：HuMSCs-FOXO1的原始生殖细胞标记物OCT4表达量在第3-10天是增高的，表达高峰在第3天；而SOX17表达量在1-3天是增高的，表达高峰在第1天。
2.2精原干细胞标记：HuMSCs-FOXO1的精原干细胞标记物ID4表达量在第1-7天以及第14天是增高的；而UCHL1表达量在第7-10天是增高的，表达高峰在第10天。
2.3减数分裂标记：HuMSCs-FOXO1的减数分裂标记物KIT表达量在第7-21天是增高的，表达高峰在第10天；而STRA8表达量在第7-21天是增高的，表达高峰在第7天。
2.4精子细胞标记：HuMSCs-FOXO1的圆形精子细胞标记物TNP2表达量在第21天是增高的；而长形精子细胞标记物PRM1表达量与对照组相比无明显变化。
3.研究男性生殖细胞条件培养体系对FOXO1转分化的调控作用：说明男性生殖细胞条件培养体系具有促进FOXO1转分化HuMSCs为男性生殖细胞的作用。
3.1利用CTG和EdU实验检测HuMSCs-FOXO1-CM的细胞增殖率显著降低（P<0.01）。
3.2原始生殖细胞标记：HuMSCs-FOXO1-CM的原始生殖细胞标记物OCT4表达量在第1天和第7天是增高的；PGC标记物SOX17表达量在1天以及第14-21天是增高的，表达高峰在第21天。
3.3精原干细胞标记：HuMSCs-FOXO1-CM的精原干细胞标记物ID4表达量在第1-21天均是增高的，表达高峰在第3天；而UCHL1表达量在10-21天是增高的，表达高峰在第21天。
3.4减数分裂标记：HuMSCs-FOXO1-CM的减数分裂标记物KIT表达量在第1天以及第7-14天是增高的，表达高峰在第14天；而STRA8表达量在第1-21天均是增高的，表达高峰在第7天。
3.5精子细胞标记：HuMSCs-FOXO1-CM的圆形精子细胞标记物TNP2表达量在第3天和第21天是显著增高的，表达高峰在第21天；而长形精子细胞标记物PRM1表达量在第7天和第21天是显著增高的，表达高峰在第21天。
【结论】
1.转录因子FOXO1可以直接转分化HuMSCs为男性生殖细胞。过表达FOXO1后，HuMSCs的干细胞多能性基因表达增高、细胞分化能力增强、减数分裂进程激活，程序化表达原始生殖细胞、精原干细胞、减数分裂、圆形精子细胞的生物学标记；
2.男性生殖细胞条件培养体系能够有效促进FOXO1转分化HuMSCs为男性生殖细胞，增强HuMSCs的程序性分化形成晚期生殖细胞的能力。