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雷公藤甲素(triptolide,TP)是从卫矛科雷公藤属木质藤本植物雷公藤中分离到的二萜内酯化合物,具有很强的抑制肿瘤生长的作用,对于各种人类的癌症和白血病有广谱的抗癌作用。多烯紫杉醇(Docetaxel,TXT)是新一代半合成紫杉类抗肿瘤药物,是现有药物中治疗转移乳腺癌和非小细胞肺癌最有效的单剂化疗药物,其作用是加强微管蛋白聚合和抑制微管解聚,导致形成稳定的非功能性维管束,从而破坏有丝分裂和细胞增殖。文献报道这是两种作用于不同细胞靶点的药物,关于这两种药物在实验上的联合应用目前未见报道。在本试验中我们以人乳腺癌细胞为实验对象,研究TP对乳腺癌细胞株的体内外抗肿瘤作用及相关机理,以及与临床常用化疗药物Docetaxel联合给药,观察联合应用是否具有协同作用,为临床合理用药提供依据。
方法：
体外实验 采用WST法筛选TP对14种乳腺癌细胞株的增殖抑制作用,并检测TP、TXT单独或联合用药对ZR-75-30细胞的抑制效应。通过不同时间TP、TXT单独或联合用药,用台盼蓝染色法观察对细胞活力的影响,DAPI荧光染色法观察细胞凋亡情况;AnnexinV/PI双染法检测细胞周期以及凋亡变化情况,real time-PCR检测对LAPs家族蛋白mRNA的影响,蛋白质印迹法(Western blot)观察IAP家族蛋白的表达和caspase-3等酶活性的变化情况。
体内实验 建立乳腺癌细胞ZR-75-30裸鼠异位移植肿瘤模型,观察肿瘤生长情况,用TP(0.05mg/kg、0.15mg/kg和0.35mg/kg)连续给药4周、TXT(7.5mg/kg)每周一次连续四周、TP与TXT联合给药4周,观察单独给药或联合给药对肿瘤的抑制作用。每周两次用游标尺测量肿瘤体积,并进行数据统计处理。
结果：
体外实验
1、在TP不同浓度作用下,14种人乳腺癌细胞株的平均IC50为9.6×10-3μM,其中5种细胞株的IC50值分别大于1×10-2μM,另外九种细胞的IC50值都小于1×10-2μM。在TXT不同浓度作用下,14种人乳腺癌细胞株的IC50平均为5.3×10-1nM,其中3种细胞株的IC50值分别大于1nM,另外十一种细胞的IC50值都小于1nM。上述结果14种乳腺癌细胞株均对TP和TXT单药作用均敏感,但TXT单药在体外对乳腺癌细胞株的增殖抑制作用比TP的抑制作用强得多。
2、TP联合TXT在一定浓度作用于乳腺癌细胞株ZR-75-30细胞,抑制率达到50％、75％、95％时CI系数均大于1,表明TP联合TXT在体外对人乳腺癌细胞株ZR-75-30的增殖具有拮抗作用,即两者联合用药降低了抗乳腺癌细胞的药效作用。
3、台盼蓝染色显示TP(1×10-2μM)作用48小时细胞存活率为83.43±2.80％,与对照组比较差异有极显著意义(P＜0.01),TXT(5×10-1nM)在48小时的细胞存活率为85.08±5.35％;两者联合用药后细胞存活率为84.11±2.50％,与单独用药比较差异无显著性意义,提示一定浓度的TP与TXT联合应用后没有使ZR-75-30细胞死亡率增高。
4、荧光显微镜观察DAPI染色后的细胞,发现凋亡细胞以TP(1×10-2μM)、TXT(5×10-1nM)以及TP(1×10-2μM)联合TXT(5×10-1nm)用药组较多见,具有明显的时效关系,且与对照组相比较差异均有极显著性意义(P＜0.01)。TP(1×10-2μM)联合TXT(5×10-1nM)用药组在24小时、48小时和72小时的凋亡细胞百分率分别为1.18±1.18％、2.73±0.91％和5.56±1.11％,凋亡细胞数量有所增加,具有时间依赖性,但与单独用药组比较差异没有显著性意义,各时间点的凋亡细胞率低于单独用药组,提示TP和TXT联合用药对ZR-75-30细胞没有协同诱导细胞凋亡的作用。
5、流式细胞术检测分析结果显示TP(1×10-2μM)处理的ZR-75-30细胞凋亡率为6.81％(早期凋亡率为6.53％,晚期凋亡率为0.28％),TXT(5×10-1nM)处理的细胞凋亡率为7.37％(早期凋亡率为7.04％,晚期凋亡率为0.33％),两组与对照组比较差异有统计学意义。TP(1×10-2μM)和TXT(5×10-1nM)联合用药的ZR-75-30细胞凋亡率为8.87％(早期凋亡率为8.58％,晚期凋亡率为0.29％),略高于单独用药组,但是差异没有统计学意义。
6、TP 1×10-2μM、3×10-2μM作用48小时,可减少ZR-75-30细胞的cIAP-1、cIAP-2 mRNA的表达,并呈量效关系,提示TP诱导ZR-75-30细胞凋亡可能与其抑制cIAP-1、cIAP-2表达有关。而TP 0.01μM与TXT 0.5nM联合用药后降低了对cIAP-1、cIAP-2P的抑制作用,从而阻止了肿瘤细胞的凋亡,表明TP与TXT的联合用药具有降低抗肿瘤疗效的作用。
7、Western blot结果显示TP(1×10-2μM)单药组与对照组相比,XIAP和cIAP-1蛋白表达降低,相应的caspase-3蛋白也被激活裂解,从而使条带浅染。而TXT(5×10-1nM)单药组与TP(1×10-2μM)单药组和对照组比较,XIAP蛋白表达有所降低,cIAP-1蛋白的表达无明显变化,caspase-3蛋白的变化也不明显;在TP(1×10-2μM)与TXT(5×10-1nM)联合给药组,XIAP和cIAP-1蛋白的表达与单药组比较明显降低,相应的caspase-3蛋白也被激活裂解,表现为这三种凋亡抑制蛋白条带的浅染和消失。cIAP-2蛋白的表达在各组中均未检测到。
上述结果有矛盾的地方,具体机制尚不清楚,有待后续研究阐明。
体内实验
1、用TP 0.05mg/kg/d、0.15mg/kg/d和0.35mg/kg/d连续给与人乳腺癌细胞ZR-75-30荷瘤裸小鼠28天,相对肿瘤增殖率分别为72.06％、69.93％和48.34％表明TP对人乳腺癌细胞ZR-75-30裸小鼠移植瘤有抑制作用。TXT 7.5mg/kg/d相对肿瘤增殖率为59.48％,有抑制作用。当TP 0.05mg/kg/d联合TXT时,其相对肿瘤抑制率为43.04％,与单药组比较抑制作用有所增强,但是差异没有统计学意义,提示两者联合用药对ZR-75-30细胞裸鼠移植瘤生长有一定的抑制效应,但与单独用药作用相比差异不是很明显,没有达到联合用药的预期结果。
2、TP单药或联合用药对裸小鼠体重没有显著影响。
结论：
1、用WST试验和台盼蓝拒染法观察TP和TXT单独用药时对体外培养的乳腺癌细胞ZR-75-30均有明显的抑制作用,TP联合TXT用药后未能增强对ZR-75-30细胞的增殖抑制作用,CalcuSyn软件分析结果显示,两者联合用药降低了抗乳腺癌细胞的药效作用。
2、DAPI染色和流式细胞术检测发现TP和TXT单独用药时能促进肿瘤细胞的凋亡率,但TP联合TXT用药后,与单药组比较未能增加对肿瘤细胞的凋亡率。
3、在mRNA水平,TP和TXT都能下调cIAP-1、cIAP-2的表达,具有剂量依赖性,表明二者在抑制凋亡抑制蛋白上有共同的靶点。TP与TXT联合用药后对cIAP-1、cIAP-2的抑制作用下降。在蛋白水平,TP可抑制人乳腺癌细胞株ZR-75-30细胞内凋亡抑制基因XIAP、cIAP-1等的表达,并促进caspase酶的裂解活化;TP与TXT联合给药对XIAP、cIAP-1表达的抑制作用以及对caspase酶裂解活化的促进作用都比单药组明显。
4、TP和TXT单独用药对人乳腺癌细胞ZR-75-30裸小鼠移植瘤均有明显的抑制作用。TP与TXT两药联合与单药组比较对ZR-75-30细胞裸鼠移植瘤生长没有明显的增强抑制肿瘤的作用。
5、鉴于TP和TXT联合用药在体外试验中没有增加肿瘤细胞的抑制作用,在体内试验中与单药组比较也没有明显的增强抑制肿瘤作用,同时由于它们的作用靶点部分相同,不存在联合用药的优势,因此临床上不宜选择TP和TXT联合用药治疗乳腺癌。