人骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的DNA甲基化调控机制

来源 :首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zmf0140
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  目的:筛选与人骨髓间充质干细胞(MSCs)转分化为汗腺样细胞过程密切相关基因启动子位点,探索DNA甲基化调控MSCs的转分化机制.方法:热休克汗腺诱导MSCs共培养10d,免疫组化检测MSCs转分化后KRT19和CEA标志,诱导MSCs分化0d、5d和10d用RT-PCR和Western blots检测CEA基因和蛋白表达情况.芯片检测MSCs分化前后45万个基因位点DNA甲基化水平变化.从甲基化水平显著变化基因位点中,筛选出与MSCs转分化密切相关基因位点.用飞行质谱技术检测关键基因启动子的甲基化水平在诱导分化前后的水平变化;筛选出的关键基因构建质粒并转染MSCs并培养,培养基内加入10ng/μL5Azd,应用RT-PCR和Western blot检测转染5天CEA基因和蛋白表达.结果:MSC经共培养10d后KRT19和和CEA免疫荧光染色示阳性,对照组KRT19和CEA示阴性.芯片检测MSC诱导分化前后共有76个基因位点的DNA甲基化水平具有明显差异(0.169‰),甲基化水平明显降低51个位点,其中SLC12A7、ENKUR、LRWD1、Pax6和HDAC4等位点甲基化水平显著下降.甲基化水平明显升高25个位点,其中Hoxd11、ADARB2、ANGPT1、UNC84A和BMP6等位点DNA甲基化水平明显升高.提示MSC转分化过程中DNA甲基化水平以下调为主.经过比较分析,选择Pax6基因位点进行飞行质谱检测,结果提示该位点甲基化水平明显降低.质粒构建Pax6转染MSCs,培养5天CEA基因表达明显增高,CEA蛋白阳性表达.结论:DNA去甲基化在MSCs分化过程中起到重要的调控作用,Pax6基因与5azd协同作用可能调控CEA基因表达影响MSC转分化.
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