【摘 要】
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目的 细胞衰老在老年性疾病发生发展过程中起重要作用,也成为治疗衰老相关疾病的重要靶点.本项实验通过博来霉素(BLM)诱导巨噬细胞衰老,建立细胞衰老模型并应用该模型观察衰老清除剂ABT263 对衰老细胞的杀伤作用.方法首先用建立BLM 诱导RAW264.7细胞衰老模型.在24孔板中,每孔接种2×104细胞,置于37℃培养箱培养24h,分别向每孔加入BLM 调至0,12.50,25.00,50.00,
【机 构】
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中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021
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目的 细胞衰老在老年性疾病发生发展过程中起重要作用,也成为治疗衰老相关疾病的重要靶点.本项实验通过博来霉素(BLM)诱导巨噬细胞衰老,建立细胞衰老模型并应用该模型观察衰老清除剂ABT263 对衰老细胞的杀伤作用.方法首先用建立BLM 诱导RAW264.7细胞衰老模型.在24孔板中,每孔接种2×104细胞,置于37℃培养箱培养24h,分别向每孔加入BLM 调至0,12.50,25.00,50.00,100.00,200.00μg/mL,继续培养72h,用β-gal试剂盒进行染色,显微镜下观察统计衰老百分比.之后测定ABT263 对RAW264.7 增殖能力的影响,将细胞分为veh组和ABT263 组,接种在96孔板,每孔接种4000个,置于37℃培养箱培养48h.veh组吸除上清加入0.2％DMSO的DMEM,继续培养24h.ABT263 组吸除上清分别加入ABT263 浓度为0,3.125,6.25,12.5,25,50μM的DMEM.继续置于37℃培养箱中培养24h.随后采用MTT 法测细胞生存率.最后测定ABT263对衰老RAW264.7 细胞的细胞毒作用.将细胞分为BLM+veh 组和BLM+ABT263 组.接种在24孔板上,每孔接种4×104个细胞,置于37℃培养箱培养24h.之后每孔加入BLM,调成50μg/mL 培养72h.之后吸除上清,BLM+veh组加入0.2％DMSO的DMEM,培养24h.BLM+ABT263 组分别加入ABT263 浓度为3.1256.25,12.5,25,50μM的DMEM溶液,培养24h.随后采用MTT法测细胞生存率.结果 BLM诱导RAW264.7 细胞出现衰老,分别为0.24％,18.79％,28.83％,46.01％,56.78％,57.21％,呈剂量依赖.测定ABT263对RAW264.7 增殖能力影响的试验中将veh组的生存率设为100％,ABT263 不同浓度组的生存率分别为109.22％、91.92％、88.64％、88.69％和10.74％.IC50=32.31μM.在测定ABT263 对衰老RAW264.7细胞的细胞毒作用试验中将BLM+veh 组的生存率设为100％,BLM+ABT263 组的生存率按浓度由低到高分别为66.03％、54.42％、46.06％、32.78％和21.88％.IC50=8.580 μM.结论(1)BLM 可以诱导RAW264.7 细胞衰老,其中50μg/mL 的BLM 可最有效诱导出衰老,构建衰老细胞模型.可用于筛选清除衰老细胞的药物.(2)在给予低剂量Bcl-2 抑制剂ABT263 时,RAW264.7 的生存率没有明显下降.当50μM 的浓度时,细胞生存率明显降低,与veh 组相比具有显著性差异.提示该模型能筛选清除衰老的药物.
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