【摘 要】
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目的 构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达载体,探讨应用超声靶向破碎微泡联合PEI介导PHD2-shRNA转染对H9C2心肌细胞PHD2基因的沉默效应,及其间接促进HIF-1α和下游促血管生成因子(VEGF、TGF-β3及bFGF)基因表达的可行性.方法 构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达质粒及对照质粒(单纯EGFP质粒).体外常氧、缺氧培养H9C2心肌细胞,分为4组：①对照质粒常氧组；
【机 构】
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430022武汉市,华中科技大学同济医学院附属协和医院超声诊断科,湖北省分子影像重点实验室
【出 处】
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第一届全国暨第二届国际超声分子影像学术会议
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目的 构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达载体,探讨应用超声靶向破碎微泡联合PEI介导PHD2-shRNA转染对H9C2心肌细胞PHD2基因的沉默效应,及其间接促进HIF-1α和下游促血管生成因子(VEGF、TGF-β3及bFGF)基因表达的可行性.方法 构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达质粒及对照质粒(单纯EGFP质粒).体外常氧、缺氧培养H9C2心肌细胞,分为4组：①对照质粒常氧组；②PHD2-shRNA常氧组；③对照质粒缺氧组；④PHD2-shRNA缺氧组.超声靶向破碎微泡联合PEI介导PHD2-shRNA和对照质粒分别对上述各组进行转染.转染48 h后荧光显微镜观察各组H9C2细胞中的荧光蛋白表达.Western blot检测PHD2、HIF-1α蛋白表达水平,RT-PCR检测VEGF、TGF-β及bFGF的mRNA表达水平.结果 测序分析证实PHD2-shRNA重组质粒构建成功；48 h后上述4组荧光显微镜下均可见荧光蛋白表达,强度无明显差异.Western-blot检测结果显示,PHD2-shRNA常氧和缺氧组PHD2蛋白条带亮度均明显低于相对应对照质粒常氧和缺氧组,而PHD2-.hRNA常氧和缺氧组HIF-1α蛋白条带亮度明显高于相对应对照质粒常氧和缺氧组.对照质粒常氧组、PHD2-shRNA常氧组、对照质粒缺氧组和PHD2-shRNA缺氧组PHD2/GAPDH吸光度比值、HIF1α/GAPDH吸光度比值两两之间比较差异具有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR分析显示PHD2-shRNA常氧和缺氧组VEGF、TGF-β和bFGF mRNA条带亮度明显高于相对应对照质粒常氧和缺氧组,各组之间不同指标两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 超声靶向破碎微泡介导PHD2-shRNA基因转染H9C2细胞后,可显著下调PHD2蛋白表达,促进HIF-1α及下游血管生成因子(TGF-β、Bfgf)基因表达,为缺血性心肌病体内基因治疗研究打下基础.
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