【摘 要】
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目的:无创及靶向的基因转染技术在现今的临床基因治疗中越来越受到重视.该研究旨在明确通过超声靶向微泡破裂联合聚乙烯亚胺是否能够有效的提高大鼠H9c2心肌细胞的基因转染率,阐述利用这一新技术,将ShRNA的基因沉默作用应用于靶向干扰Bax基因.方法:构建靶向Bax基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,将其与微泡及PEI共同处理后加入大鼠心肌H9c2细胞并予以超声
【出 处】
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中国超声医学工程学会第十二届全国超声心动图学术会议
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目的:无创及靶向的基因转染技术在现今的临床基因治疗中越来越受到重视.该研究旨在明确通过超声靶向微泡破裂联合聚乙烯亚胺是否能够有效的提高大鼠H9c2心肌细胞的基因转染率,阐述利用这一新技术,将ShRNA的基因沉默作用应用于靶向干扰Bax基因.
方法:构建靶向Bax基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,将其与微泡及PEI共同处理后加入大鼠心肌H9c2细胞并予以超声辐照,实验分组为:1)单纯质粒组,2)阳性对照组(Liposuction2000+质粒组),3)PEI+质粒组,4)UTMD+质粒组,5)PEI+UTMD+质粒组,6)PEI+SonoVue+质粒组(无超声辐照).采用荧光显微镜和FCM法评估基因转染效率,同时对超声辐照参数进行优化;应用Hoechst染色分析法检测细胞凋亡;应用RT-PCR检测Bax mRNA水平的变化,Western Blot检测蛋白表达情况.应用原子力声显微镜观察心肌母细胞亚细胞结构及声学图像特点.
结果:经酶切鉴定及测序分析证实重组质粒构建成功.H9c2细胞采用UTMD+PEI处理后,基因转染率显著增加(P＜0.01),并在超声固定频率1MHz,强度为1.0W/cm2、辐照40s,占空比为20％的条件下最为显著(P＜0.01).PT-PCR检测结果显示,质粒与微泡+PEI共同作用加超声辐照组的Bax mRNA抑制率均显著高于各对照组(P＜0.01);Western Blot检测结果显示,质粒与微泡+PEI共同作用加超声辐照组的Bax基因蛋白表达抑制率明显高于各对照组(P＜0.01);Hoechst染色检测结果显示,只有经脂质体或UTMD转染处理后的细胞中可检测到明显的细胞凋亡形态,其余各组均未检测到明显凋亡.
结论:UTMD能够协同帮助其他基因转导方法在活体内的应用发展.能够作为一种安全、有效、无创的基因转导系统.UTMD联合PEI,能够显著增强组织中质粒的基因表达,是一种有发展前景的活体内基因转导方法.这种无创的、全新的超声靶向微泡破裂联合聚乙烯亚胺能明显增加大鼠H9c2心肌细胞转染率及基因的表达,有效的沉默Bax基因.这种非病毒的转染方式能帮助通过shRNA沉默Bax基因的表达,抑制细胞凋亡,有望成为有效的心脏疾病的基因治疗方法.
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