【摘 要】
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目的：我们以腺病毒为载体(Ad),携带角化细胞生长因子(KGF)基因的方法,利用复制缺陷型腺病毒载体重组KGF基因,证明其强感染能力与转基因能力,能在体外体内特异性表达有活性的KGF蛋白,证明其定向修复组织损伤的作用.方法：通过Pac Ⅰ核酸内切酶酶切鉴定腺病毒质粒(pAd-KGF),并进行测序.pAd-KGF线性化后转染进HEK 293 (293)细胞,制备Ad-KGF.观察病毒感染正常细胞系P
【机 构】
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浙江大学医学院附属口腔医院 浙江大学医学院附属第一医院
【出 处】
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2014全国口腔生物医学学术年会暨“西湖国际”口腔医学高峰论坛
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目的：我们以腺病毒为载体(Ad),携带角化细胞生长因子(KGF)基因的方法,利用复制缺陷型腺病毒载体重组KGF基因,证明其强感染能力与转基因能力,能在体外体内特异性表达有活性的KGF蛋白,证明其定向修复组织损伤的作用.方法：通过Pac Ⅰ核酸内切酶酶切鉴定腺病毒质粒(pAd-KGF),并进行测序.pAd-KGF线性化后转染进HEK 293 (293)细胞,制备Ad-KGF.观察病毒感染正常细胞系PA317,HUVEC,HaCaT和293细胞后；通过EUSA,半定量PCR和荧光定量PCR检测KGF表达水平；确通过划痕实验和细胞迁移实验观察KGF和Ad-KGF对不同细胞系的生长迁移作用.改良皮瓣手术,在术后第15天,25天,和45天处死大鼠,组织化学染色分析.另取60只大鼠,建立背部皮瓣模型,分别注入不同药物分为四组：1ml PBS+dexamethasone (DXM),1 ml PBS+Ad-KGF+DXM,or 1 ml PBS+Ad+DXM.术后第15天,25天,和35天处死,Masson染色、免疫组化分析和荧光定量PCR分析,血清ELISA检测.结果：1.酶切鉴定及测序结果与设计和文献相符.病毒转染正常293细胞,96小时后293产生细胞病理效应,表达大量荧光蛋白.重组腺病毒收集后测得Ad-KGF病毒的效价滴度为2×1011PFU/m1,Ad病毒的效价滴度为3×1012PFU/m1.2.半定量PCR证明pAd-KG内存在KGF表达基因.经过基因重组后的腺病毒Ad-KGF具有感染正常细胞,于正常细胞内表达KGF的能力.EUSA检测证明Ad空病毒转染细胞后,不分泌KGF蛋白,而Ad-KGF转染细胞能够检测到大量的KGF表达.划痕实验和Transwell细胞迁移实验证明KGF能有效促进HaCaT细胞生长迁移,而对HUVEC血管内皮细胞作用不明显,对PA317成纤维细胞没有明显作用.3.大鼠背部七条静脉和一侧有超过二十条动脉分布.组织学检查可见术后15天,坏死创口边缘上皮细胞增生明显,创口愈合区有大量小脉管形成和大量不成熟的纤维成分形成.至第35天,上皮增生修复较前明显弱,但较正常上皮,厚度仍明显增大4.术后第十天,坏死面积达到最大.随着不同药物的治疗,坏死面积在各组间都明显下降,且AdKGF组坏死面积缩小最为明显.术后35天,Ad-KGF组坏死伤口已经愈合,而其它三组还有较大的坏死面积.免疫组化显示,Ad-KGF组上皮和间充质细胞中有强阳性KGF表达.Anti-CD34免疫组化显示四组的小血管生成数目相当.结论 1.pAd-KGF经过酶切鉴定和测序鉴定具有KGF完全匹配的基因组.成功构建Ad-KGF和Ad.2.Ad-KGF和Ad可以高效转染不同细胞系,并高效表达活性KGF,可有效促进HaCaT生长,而对PA317、HUVEC细胞作用不明显.3.成功建立了稳定的大鼠背部皮瓣坏死伤口模型.4.使用高表达KGF的腺病毒转染大鼠背部皮瓣坏死伤口,能有效促进坏死伤口的愈合.
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