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反刍动物瘤胃中含有大量能分泌木聚糖酶的微生物,然而通过纯培养技术分离到的微生物种类极少.为了开发新型木聚糖酶基因资源,获取优良的木聚糖酶基因,本实验室构建了湖羊瘤胃微生物Fosmid文库,采用刚果红染色分析筛选具有木聚糖酶活性的阳性克隆,选取透明圈最大的克隆进行测序分析.设计引物,PCR分别扩增木聚糖酶基因全长和催化域,经HindⅢ和BamHI双酶切,与原核表达载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),经1mmoL/L IPTG诱导表达后,超声波破碎菌体回收蛋白,用Ni-NTA树脂亲和层析纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析检测其分子量,采用Bradford法测定蛋白含量,以1％的木聚糖为底物,DNS还原糖法测定酶活性,计算比活力.在pH值6.0的条件下,测定酶的最适反应温度；在50℃、60℃、70℃和80℃条件下分别孵育不同时间(2min、10min、30min、60min)后测定酶的残余活性,分析酶的热稳定性.在最适温度条件下,分别测定ORF6-UN和ORF6的最适pH值；在室温(25℃)条件下,测定酶在不同pH值缓冲液中孵育2h后的残余活性,分析酶的pH值稳定性.结果显示从Fosmid文库的12 704个克隆中筛选到18个具有木聚糖酶活性的阳性克隆.序列分析结果表明,HF94含有一个编码内切木聚糖酶的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)6,编码355个氨基酸,该蛋白与产琥珀酸丝状杆菌S85产生的β-1,4-内切木聚糖酶氨基酸序列相似性为61％,由催化域(ORF6-UN)、连接肽和一个未知区域三部分构成,该催化域属于糖基水解酶家族11(GH11)(plam00457).SDS-PAGE和Western blot结果显示,ORF6和ORF6-UN蛋白的分子量分别约为43ku和34ku,与推导的蛋白分子量一致.纯化后ORF6的比活力为616.67U/mg,最适反应温度为60℃,最适pH值为5.0；纯化后ORF6-UN的比活力为1 150.00U/mg,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.0.未知区域的存在降低了木聚糖酶的比活性,但是却增加了它的热稳定性和pH值稳定性.结果表明,该木聚糖酶比活力较高,优于从环境中分离得到的其他木聚糖酶,具有进一步研究和应用的潜质.