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目的：建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast cancerresistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系PA317／BCRP，初步探讨其耐药机制。
方法：从乳腺癌耐药细胞系MCF-7／ADR中克隆BCRP基因。将编码序列克隆导入真核表达载体pcDNA3．1，转化感受态E．Coli DH5α，获得重组质粒pcDNA3．1／BCRP，酶切并测序鉴定。用电穿孔法将质粒转染PA317细胞，同时转染pcDNA3．1／EGFP。G418筛选阳性克隆。阳性转染细胞提取细胞总RNA，RT-PCR检测BCRP的mRNA表达，Western blot检测BCRP蛋白表达。MTT法检测耐药克隆PA317／BCRP细胞对米托葸醌(Mitoxantrone，MTZ)耐药性，罗丹明123外排实验验证转染后细胞外排罗丹明123功能。Western blot检测PI3K-AKT信号转导通路下游靶点AKT表达变化。
结果：构建质粒pcDNA3．1／BCRP，转染PA317细胞，G418筛选。RT-PCR和Western blot，均检测到细胞中BCRP基因转录及蛋白表达。与空质粒转染细胞、未转染细胞对照组相比，PA317／BCRP细胞对MTZ耐药性增强，且外排罗丹明123能力增强。检测PI3K-AKT途径下游靶点AKT蛋白磷酸化水平在PA317／BCRP细胞内明显增高。
结论：
1.成功获得稳定表达BCRP的PA317细胞系——PA317／BCRP，经MTT和罗丹明123外排实验证实，其耐药和外排功能增强。
2.检测PA317／BCRP细胞PI3K-AKT途径下游靶点AKT的表达，观察到耐药细胞的AKT表达含量明显高于转染空质粒和未转染的PA317细胞。推测BCRP可能通过影响AKT表达上调发挥其耐药作用。