【摘 要】
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目的：构建能表达小鼠Ankrd 17基因的小发卡RNAs(shRNAs)慢病毒载体,为选择性沉默Ankrd17基因在神经干细胞(NSCs)中的表达奠定基础;研究NSCs Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其增殖、分化功能和凋亡以及对其Wnt信号通路相关分化基因表达的影响,以明确Ankrd17分子与MCMV嗜神经蛋白M122的相互作用与胎脑发育异常机制的关系;为明确MCMV致神经系统损伤机制提供
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科 450052
【出 处】
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中华医学会第十八次全国儿科学术会议
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目的：构建能表达小鼠Ankrd 17基因的小发卡RNAs(shRNAs)慢病毒载体,为选择性沉默Ankrd17基因在神经干细胞(NSCs)中的表达奠定基础;研究NSCs Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其增殖、分化功能和凋亡以及对其Wnt信号通路相关分化基因表达的影响,以明确Ankrd17分子与MCMV嗜神经蛋白M122的相互作用与胎脑发育异常机制的关系;为明确MCMV致神经系统损伤机制提供新的思路和依据.方法：构建小鼠An krd 17基因的小发卡RNAs(shRNAs)慢病毒载体,制备慢病毒液并用逐孔稀释法测定病毒滴度;通过荧光显微镜观察荧光表达情况来判断慢病毒感染NSCs的最适感染条件,Real-Time PCR检测其对NSCs中Ankrd 17基因的干扰效率.实验分组为:①慢病毒干扰+MCMV感染组;②MCMV感染对照组;③慢病毒干扰对照组;④正常对照组;每组设3复孔;用CCK-8法检测神经干细胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其增殖的影响;用流式细胞术检测神经干细胞Ankrd 17基因沉默后MCMV感染对其分化的影响;用PI染色法检测神经干细胞Ankrd 17基因沉默后MCMV感染对其凋亡的影响;用Real-Time PCR方法检测神经干细胞Ankrd 17基因沉默后MCMV感染对其Wnt信号通路相关基因(ngn2)表达的影响.结果：成功制备出表达Ankrd 17基因shRNA的慢病毒颗粒浓缩液，病毒滴度为1.0×1O8TU/mL;荧光显微镜下观察发现，NSCs在转染慢病毒颗粒5d后，在MOI=5并添加5μg/ml的polybrene的转染条件下转染效率最好，Real-Time PCR结果显示，与空病毒组和正常细胞对照组相比，pLVX-shRNA-Ankrd 17-1可以明显降低NSCs中Ankrd 17表达水平，其沉默效率达到67.3％。与MCMV感染对照组相比，慢病毒干扰+MCMV感染组的细胞增殖活性明显升高(p<0.05）。在分化培养3d后，慢病毒干扰组nestin的表达水平明显高于正常对照组(p<0.05)，而GFAP和NSE的阳性比率亦明显低于正常对照组(p<0.05 );而慢病毒干扰+MCMV感染组在分化培养第3d时，其GFAP和NSE的阳性细胞率明显高于感染对照组(p<0.05)。结论：成功构建了小鼠Ankrd17基因shRNA慢病毒载体pLVX-shRNA-Ankrd17;该慢病毒载体可以有效沉默胎鼠NSCs的Ankrd17基因;选择性沉默神经干细胞Ankrd 17基因后，MCMV感染对NSCs的增殖活性和早期NSCs分化的抑制程度明显减弱，并导致NSCs的凋亡比率增高;选择性沉默神经干细胞Ankrd17基因可部分减轻MCMV诱导的NSCs Wnt信号通路分化相关基因wnt1,wnt3,wnt7a,ngn1和ngn2的表达异常;MCMV嗜神经蛋白M 122蛋白可通过与神经干细胞Ankrd17分子相互作用，干扰NSCs的Wnt信号通路分化相关基因表达进而抑制NSCs的增殖和分化，这可能是先天性CMV感染所致胎脑发育异常的重要机制之一。
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